高效異養硝化細菌的分離篩選及多樣性分析

摘要：采用生長曲線指導的富集培養法，從生活污水排放渠中分離篩選出高效異養硝化細菌，并對其多樣性進行了分析。結果顯示，從分離得到的27株異養硝化細菌中篩選出6株高效菌株Ni1-2、Ni1-8、Ni2-5、Ni2-7、Ni3-1和Ni3-4，其48 h氨氮去除率分別為88.9%、76.6%、87.7%、93.1%、99.2%和91.4%；結合菌落形態、革蘭氏染色反應、掃描電鏡觀察和16S rDNA序列分析，發現菌株的種類較為豐富，初步確定Ni1-2和Ni1-8為節桿菌屬（Arthrobacter），Ni2-5和Ni3-1為產堿桿菌屬（Alcaligenes），Ni2-7為無色桿菌屬（Achromobacter），Ni3-4為芽孢桿菌屬（Bacillus）。該結果可為高效異養硝化菌的分離篩選及其多樣性分析提供參考。

關鍵詞：異養硝化；節桿菌屬（Arthrobacter）；產堿桿菌屬（Alcaligenes）；無色桿菌屬（Achromobacter）；芽孢桿菌屬（Bacillus）

中圖分類號：X703 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）05-1181-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.039

Abstract：High-efficient heterotrophic nitrifying bacterial strains were isolated from sewage ditches after enrichment and cultivation guided by growth curves. The diversity of these bacterial strains was analyzed. Six strains named as Ni1-2， Ni1-8， Ni2-5， Ni2-7， Ni3-1 and Ni3-4 were screened from 27 isolates for their high-efficient heterotrophic nitrification. The NH4+-N removal ratio of the six strains within 48 h reached 88.9%， 76.6%， 87.7%， 93.1%， 99.2% and 91.4%， respectively. Based on colony morphology observation， Gram stain， scanning electron microscope observation and homology analysis of 16S rDNA sequence， the six strains had diversity. Ni1-2 and Ni1-8 were identified as Arthrobacter. Ni2-5 and Ni3-1 were identified as Alcaligenes. Ni2-7 was identified as Achromobacter and Ni3-4 was identified as Bacillus. It will provide technical support for screening high-efficient heterotrophic nitrifying bacterial strains and studing their biodiversity.

Key words：Heterotrophic nitrification；Arthrobacter；Alcaligenes；Achromobacter；Bacillus

隨著工農業生產的發展和人民生活水平的提高，未經適當處理的含氮廢水，如生活污水、工業、種植業及禽畜養殖業廢水等，大量排放入江河湖泊，造成了越來越嚴重的水體富營養化問題，危害到農業、漁業、旅游業等諸多行業，對飲水衛生和食品安全也構成了巨大威脅。近年來，國內外在脫氮微生物菌株的篩選和培育研究方面非常活躍，一些異養硝化菌、好氧反硝化菌、自養反硝化菌、厭氧氨氧化菌等非傳統脫氮微生物不斷被發現[1-4]，為研究開發經濟有效的氮污染物凈化技術提供了新的理論和思路。

異養硝化菌是指在好氧條件下能將氨氮或還原態有機態氮氧化成羥胺、亞硝酸鹽和硝酸鹽的一類微生物[5]。異養硝化微生物的發現，是對傳統硝化理論的豐富與突破，特別是一些異養硝化微生物同時具有好氧反硝化的特性，可實現同步硝化反硝化的全新脫氮工藝[6]。因此，異養硝化微生物的重要性日益受到關注[7-10]。

異養硝化微生物種類繁多，分布于藻類、放線菌、真菌和細菌中[7]。由于其遺傳背景的差異性，不同的異養硝化微生物的生長及硝化特點都有所不同[6]。并且異養硝化菌可以利用的基質范圍廣泛，如銨、胺、酰胺、N-烷基羥胺、肟、氧肟酸及芳香硝基化合物等，這使得異養硝化機理到目前仍不清楚，其代謝途徑也未被確定和證實[11]。從自然環境中分離不同的異養硝化菌，對研究異養硝化途徑和異養硝化微生物多樣性，以及開發新型高效脫氮工藝具有重要意義。為此，本研究通過四級富集培養法從生活污水排放渠中分離篩選高效異養硝化細菌，分析其多樣性，為異養硝化菌的理論研究和應用研究提供材料。

1 材料和方法

1.1 環境樣品

采集排污溝渠距水面10 cm處的水樣以及其附近10 cm深度的土樣。采樣后立即用于異養硝化細菌的篩選。

1.2 培養基

富集培養基（pH 7.0）：C6H5O7Na3 5.00 g，（NH4）2SO4 1.24 g，KH2PO4 1.00 g，Na2HPO4 7.85 g，NaCl 0.50 g，MgSO4 0.05 g，微量元素溶液[12] 1 mL，補充去離子水至1 L。用于異養硝化菌的富集培養。

異養硝化培養基（pH 7.0）：C6H5O7Na3 7.50 g，（NH4）2SO4 0.66 g，Na2HPO4 3.7 g，其余成分同富集培養基。固體培養基添加1.5%的瓊脂。用于異養硝化菌的分離純化及氨氮去除能力研究。

牛肉膏蛋白胨培養基（pH 7.2）：牛肉膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，補充去離子水至1 L。固體培養基添加1.5%的瓊脂。用于菌株的形態觀察、保存及活化。

1.3 異養硝化菌的篩選

1.3.1 富集培養 取土樣10 g或水樣10 mL加入到90 mL含有玻璃珠的無菌水中，震搖30 min使樣品充分分散。取上清5 mL接種到95 mL富集培養基中，于30 ℃，160 r/min搖床震蕩培養，每隔2 h測定富集液的OD600 nm繪制生長曲線，在穩定期初期轉接20 mL培養液至80 mL新鮮的富集培養基中繼續培養，連續轉接4次。富集期間定期檢測培養液中氨氮含量，若氨氮顯著減少，表示富集液中含有硝化微生物，可用于后續分離純化試驗。

1.3.2 分離純化 取富集培養液作梯度稀釋，涂布固體異養硝化培養基平板，30 ℃培養3 d，挑取不同形態的菌落接種到液體異養硝化培養基中，30 ℃震蕩培養36 h，檢測培養液中氨氮的含量，將氨氮去除率較高的培養液再次稀釋涂布平板進行分離和篩選，直到得到氨氮去除效果較好的純培養菌株。

1.4 菌株的多樣性分析

1.4.1 形態觀察 將分離得到的菌株涂布牛肉膏蛋白胨平板，30 ℃培養2 d，觀察菌株的菌落形態、革蘭氏染色反應以及掃描電子顯微鏡下的細胞形態。

1.4.2 16S rDNA的PCR擴增、測序和系統發育分析 用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA作為模板，采用通用引物[13] 27F（5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′）和1492R（5′-TAC CTT GTT ACG ACT T-3′）進行16S rDNA序列的PCR擴增。擴增體系（50 μL）：10×Pfu Buffer 5 μL， 2.5 mmol/L dNTP 2 μL， 10 μmol/L引物各2.0 μL， 基因組DNA 50 ng，Pfu DNA聚合酶 2 U，加ddH2O至50 μL。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，28個循環；72 ℃ 8 min。PCR產物的純化和測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。測序所獲序列在NCBI核酸數據庫中進行BLAST比對分析，下載部分相似性高的序列及一些常見的異養硝化細菌和自養硝化細菌的16S rDNA序列，利用MEGA 5.1軟件中基于Kimura 2-parameter模型的Neighbour-joining （NJ）鄰接法構建系統發育樹[14]。

1.5 氨態氮（NH4+-N）的檢測

定性檢測：取600 μL待測樣品于比色板上，滴加50 μL鈉氏試劑，呈黃色，則培養液中含氨氮，顏色越深，氨氮含量越高。

定量檢測：采用國家環境保護標準《水質氨氮的測定—鈉氏試劑分光光度法》（HJ 535-2009）。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離純化

通過生長曲線指導的四級富集培養得到氨氮殘留量較少的培養液，對稀釋后的培養液進行涂布平板分離和連續多次劃線純化，成功獲得具有異養硝化能力的異養型菌株共27株，分別編號為Ni1-1—Ni1-13，Ni2-1—Ni2-9，Ni3-1—Ni3-5。

2.2 菌株的篩選

將分離純化后的菌株在異養硝化培養基中培養3 d，各取600 μL培養液于白色的比色板上，用定性檢測方法檢測氨氮的去除情況，結果見表1。由表1可知，菌株Ni1-2、Ni1-8、Ni2-5、Ni2-7、Ni3-1、Ni3-4培養液用納氏試劑顯色后顏色較淺，表明培養液中氨氮殘留量較少，這6株菌株的異養硝化能力較強。

2.3 菌株的氨氮去除率

將篩選得到的6株異養硝化能力較強的菌株接種于液體異養硝化培養基中，30 ℃ 60 r/min搖床培養48 h， 檢測氨氮濃度的變化， 結果顯示6株菌株的氨氮去除效果較好（表2），氨氮去除率為76.6%～99.2%。

2.4 菌株的多樣性分析

2.4.1 形態學分析 將活化后的菌株在牛肉膏蛋白胨培養基中30 ℃培養2 d后，分別觀察其菌落形態、菌體細胞形態和革蘭氏染色反應。結果顯示，6株菌株在菌落大小、顏色、形狀、邊緣、表面光澤、透明程度、以及菌體細胞大小和形態方面的差異明顯（表3，圖1和圖2），呈現出較好的多樣性。

2.4.2 16S rDNA序列分析 用引物27F和1492R對6株菌株的基因組DNA進行PCR擴增并測序，均得到長約為1.5 kb的16S rDNA序列，將所獲序列提交GenBank數據庫，登錄號見表4。用BLAST程序與GenBank中核酸數據庫進行同源性分析，發現Ni1-2、Ni1-8、Ni2-5、Ni2-7、Ni3-1、Ni3-4的16S rDNA序列分別與Arthrobacter sp. 5118 （JX566636）、Arthrobacter sp. W1（EU339930）、Alcaligenes faecalis TZQ4 （HQ143627.1）、Achromobacter sp. SR4（KC577545）、Alcaligenes faecalis B_IV_2L10 （JF710956.1）、Bacillus licheniformis CGMCC 2876 （GQ148817.1）的一致性均達98%以上（表4）。利用MEGA5.1軟件中基于Kimura2-parameter模型的Neighbour-joining （NJ）鄰接法構建系統發育樹見圖3。從圖3可知，6株菌株聚為4個類群，其中Ni1-2和Ni1-8與節桿菌屬（Arthrobacter）的親緣關系較近，Ni3-4與芽孢桿菌屬（Bacillus）的親緣關系較近，Ni2-7與無色桿菌屬（Achromobacter）的親緣關系較近，Ni2-5和Ni3-1與產堿桿菌屬（Alcaligenes）的親緣關系較近。

3 小結與討論

傳統氮循環理論認為，執行硝化作用的微生物是一群生長緩慢的化能自養型硝化細菌[10]。自1949年Quastel等[15]以丙酮肟作為選擇性培養基，首次分離獲得異養硝化菌株以來，異養硝化微生物和異養硝化作用引起研究者們的廣泛關注。研究發現，與自養硝化細菌相比，雖然異養硝化細菌單位菌體的硝化活性低，但其生長速率快，在有大量有機物存在條件下，對氧氣和營養物的競爭比自養細菌強，容易成為優勢菌，而且異養硝化細菌對高濃度氨氮的耐受性強[10，16]，因此異養硝化細菌對污水中氨氮的凈化作用不可小覷。

本研究在富集培養異養硝化細菌時，用生長曲線指導富集培養的時間，在對數生長結束后立即進行轉接，使自養硝化菌來不及充分生長而快速被淘汰，從而增加分離異養硝化菌的成功率。在初篩時，以鈉氏試劑為指示劑對氨氮進行定性檢測，在操作上簡單快速，可大大提高篩選效率。

目前報道的異養硝化細菌有糞產堿桿菌（Alcaligenes faecalis）[17]、施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）[18]、惡臭假單胞菌（P. putida）[19]、醋酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）[1]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[20]、泛養硫球菌（Thiosphaera pantotropha）[21]、球形節桿菌（Arthrobacter globiformis）[22]、脫氮副球菌（Paracoccus denitrificans）[23]等。通過16S rDNA序列分析，本研究從1份環境樣品中篩選得到4個不同屬的高效異養硝化細菌共6株，結合菌落形態、革蘭氏染色反應、掃描電鏡觀察和16s DNA序列的比對分析，初步確定Ni1-2和Ni1-8為節桿菌屬（Arthrobacter），Ni2-5和Ni3-1為產堿桿菌屬（Alcaligenes），Ni2-7為無色桿菌屬（Achromobacter），Ni3-4為芽孢桿菌屬（Bacillus），菌株的種類較為豐富。該結果可為高效異養硝化菌的獲得及其多樣性分析提供參考。

參考文獻：

[1] ZHAO B， HE Y L， HUGHES J， et al. Heterotrophic nitrogen removal by a newly isolated Acinetobacter calcoaceticus HNR [J]. Bioresource Technology， 2010， 101（14）： 5194-5200.

[2] KHARDENAVIS A A， KAPLEY A， PUROHIT H J. Simultaneous nitrification and denitrification by diverse Diaphorobacter sp[J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2007， 77（2）： 403-409.

[3] KIM J K， PARK K J， CHO K S， et al. Aerobic nitrification-denitrification by heterotrophic Bacillus strains [J]. Bioresource Technology， 2005， 96（17）： 1897-1906.

[4] SU J J， LIU B Y， LIU C Y. Comparison of aerobic denitrification under high oxygen atmosphere by Thiosphaera pantotropha ATCC 35512 and Pseudomonas stutzeri SU2 newly isolated from the activated sludge of a piggery wastewater treatment system[J]. Journal of Applied Microbiology， 2001， 90（3）： 457-462.

[5] 何 霞，趙 彬，呂 劍，等.異養硝化細菌Bacillus sp. LY脫氮性能研究[J]. 環境科學，2007，28（6）：1404-1408.

[6] 茍 莎，黃 鈞.異養硝化細菌脫氮特性及研究進展[J].微生物學通報，2009，36（2）： 255-260.

[7] 何 霞，呂 劍，何義亮，等.異養硝化機理的研究進展[J].微生物學報，2006，46（5）：844-847.

[8] CHEN P， LI J， LI Q X， et al. Simultaneous heterotrophic nitrification and aerobic denitrification by bacterium Rhodococcus sp. CPZ24[J]. Bioresource Technology， 2012， 116： 266-270.

[9] VELUSAMY K， KRISHNANI K K. Heterotrophic nitrifying and oxygen tolerant denitrifying bacteria from greenwater system of coastal aquaculture[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology， 2013， 169（6）： 1978-1992.

[10] KATHIRAVAN V， KRISHNANI K K. Pseudomonas aeruginosa and Achromobacter sp.： nitrifying aerobic denitrifiers have a plasmid encoding for denitrifying functional genes[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology， 2014， 30（4）： 1187-1198.

[11] 郭建華，彭永臻.異養硝化、厭氧氨氧化及古菌氨氧化與新的氮循環[J]. 環境科學學報，2008，28（8）：1489-1498.

[12] 曾慶梅，司文攻，李志強，等.一株高效異養硝化菌的選育、鑒定及其硝化條件[J]. 微生物學報，2010，50（6）：803-810.

[13] FRANK J A， REICH C I， SHARMA S， et al. Critical evaluation of two primers commonly used for amplification of bacterial 16S rRNA genes[J]. Appl Environ Microbiol. 2008， 74（8）： 2461-2470.

[14] TAMURA K， PETERSON D， PETERSON N， et al. MEGA5： molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood， evolutionary distance， and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution. 2011， 28（10）： 2731-2739.

[15] QUASTEL J H， SCHOLEFIELD P G. Influence of organic nitrogen compounds on nitrification in soil[J]. Nature （London）， 1949， 164（4182）： 1068-1072.

[16] JOO H S， HIRAI M， SHODA M. Improvement in ammonium removal efficiency in wastewater treatment by mixed culture of Alcaligenes faecalis no. 4 and L1[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering， 2007， 103（1）： 66-73.

[17] JOO H S， HIRAI M， SHODA M. Characteristics of ammonium removal by heterotrophic nitrification-aerobic denitrification by Alcaligenes faecalis No. 4[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering， 2005， 100（2）： 184-191.

[18] ZHANG J， WU P， HAO B， et al. Heterotrophic nitrification and aerobic denitrification by the bacterium Pseudomonas stutzeri YZN-001[J]. Bioresource Technology， 2011， 102（21）： 9866-9869.

[19] DAUM M， ZIMMER W， PAPEN H， et al. Physiological and molecular biological characterization of ammonia oxidation of the heterotrophic nitrifier Pseudomonas putida[J]. Current Microbiology， 1998， 37（4）： 281-288.

[20] YANG X P， WANG S M， ZHANG D W， et al. Isolation and nitrogen removal characteristics of an aerobic heterotrophic nitrifying-denitrifying bacterium， Bacillus subtilis A1[J]. Bioresource Technology， 2011， 102（2）： 854-862.

[21] CASTIGNETTI D. Bioenergetic examination of the heterotrophic nitrifier-denitrifier Thiosphaera pantotropha[J]. Antonie Van Leeuwenhoek， 1990， 58（4）： 283-289.

[22] KUROKAWA M， FUKUMORI Y， YAMANAKA T. A hydroxylamine-cytochrome c reductase occurs in the heterotrophic nitrifier Arthrobacter globiformis [J]. Plant and Cell Physiology， 1985， 26（7）： 1439-1442.

[23] CROSSMAN L C， MOIR J W， SPIRO S， et al. Heterotrophic nitrification in Paracoccus denitrificans[J]. Biochemical Society Transactions， 1998， 26（3）： 208.