一株產香真菌的篩選鑒定及脂肪酶基因序列克隆分析

摘要：從香料植物天竺葵上分離篩選到一株產香真菌，對該菌株進行鑒定，確定其分類地位，并克隆其產脂肪酶基因進行序列分析。結果表明，分離篩選得到的菌株TZK-1形態為菌落圓形，質地疏松，菌絲由白色變為灰褐色，菌絲無隔膜，有假根，孢囊梗基部膨大形成球形孢子囊，孢囊孢子橢圓形；該菌株18S rDNA序列與米根霉Rhizopus oryzae（KF717370）相應片段的核苷酸序列同源性為99.6%。利用PCR擴增得到脂肪酶基因，該基因編碼區全長為1 108 bp，編碼369個氨基酸，脂肪酶核苷酸序列與推導的氨基酸序列與Rhizopus oryzae（AF229435）和Rhizopus oryzae（JN689988）聚為一支，支持強度分別達到92%和95%。結合形態學初步確定，產生濃郁甜酒香味的菌株為米根霉，能產生脂肪酶，克隆其脂肪酶基因全長。

關鍵詞：真菌；篩選；脂肪酶；PCR擴增

中圖分類號：S188 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）05-1227-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.050

Abstract： A strain of aroma-producing fungi isolated from spices plant geranium and identified. Its classification status was determined. The lipase gene was cloned and sequenced. The results showed that colonies of isolated strain TZK-1 were round， loose texture， hyphae from white to gray brown. Microscopic examination of hyphae were observed without the diaphragm， but had a rhizoid， sporangiophore base expanded to form spherical sporangia， sporangiospores oval. 18S rDNA sequence of the strain and Rhizopus oryzae（KF717370） had homology of 99.6%. The lipase gene was amplified by PCR method. The full-length coding region of the gene was 1 108 bp， encoding 369 amino acids. Amino acid sequences of nucleotide sequence of the lipase and Rhizopus oryzae （AF229435） and Rhizopus oryzae（JN689988） were clusteried within a branch， with homology of 92% and 95%， respectively. Combined with a preliminary determination of morphology， the strains of Rhizopus oryzae had strong wine flavor， produced lipase. The full-length of lipase gene was cloned.

Key words： fungi；screening；lipase；PCR amplification

脂肪酶（Lipase，E.C.3.1.1.3）是一類特殊的酯酶，可以在油水界面上催化長鏈甘油酯水解為長鏈脂肪酸和甘油，在非水相系統中，可以催化轉酯和酯合成等多種反應[1]。通過改變反應體系的水含量便可以控制脂肪酶催化的反應方向，可以進行水解、酯合成、酯交換、轉酯化等一系列反應。脂肪酶在常溫常壓下反應具有反應條件溫和、轉化率高和特異性強，不易產生副產物等特點，從而能避免化學催化帶來的有害物質。因此，脂肪酶越來越多地運用于光學活性化合物和天然產物的合成，如在食品、飼料、洗滌、紡織、能源等加工業中應用廣泛[2，3]，成為重要的工業酶制劑之一。脂肪酶廣泛存在于植物、動物和微生物中，其中微生物脂肪酶具有種類多、底物專一性類型多、獨立的脂肪酶基因易獲得等優點[4]，因而微生物是脂肪酶的一個重要來源，其中根霉屬（Rhizopus sp.）是脂肪酶的重要生產菌[5]。根霉屬（Rhizopus sp.）是一類分布較為廣泛的真菌，屬于接合綱毛霉目毛霉科，分布于酒曲、植物殘體、腐敗有機物、動物糞便和土壤中，在傳統和現代發酵工業中有著重要作用。其中與生物技術相關的根霉有匍枝根霉（R.stolonifer）、華根霉（R.chinensis）[6]、德氏根霉（R. delemar）[7]和米根霉（R.oryzae）[8-11]。目前已從根霉屬中分離到超過30種脂肪酶，如米根霉脂肪酶、雪白根霉脂肪酶、德氏根霉脂肪酶等，這些酶已經商品化，如根霉脂肪酶用于芳香酯[6]、生物柴油[12]、手性化合物[13]等有機化學物的制備，因此根霉脂肪酶具有一定的研究價值。

目前，已經從不同種屬的微生物中分離得到產脂肪酶菌株，并對其進行了深入研究。隨著分子生物學[14]的發展，國內外報道了不同來源微生物脂肪酶基因已被成功克隆[15]，通過數據庫比對分析脂肪酶序列，可以發現在相同或者相近的種屬內脂肪酶的同源性相對較高，從而找到相對保守的結構域。本研究從石林香料植物天竺葵葉表面分離到一株產脂肪酶菌株，通過提取基因組DNA以真菌通用引物（ITS1/ITS4）進行PCR擴增，并結合形態學對該菌株進行鑒定，然后設計引物利用PCR擴增米根霉脂肪酶全基因序列，并對分離菌株進行發酵代謝成分分析，為米根霉的運用提供了異源表達和分子育種材料，為其代謝產物的研究和開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 由石林香料天竺葵樣品中自行分離、純化并保存的菌株。

1.1.2 主要試劑和儀器 酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、牛肉膏、乙酸乙酯、無水硫酸鈉等均為國產分析純；2×Power Taq PCR Master Mix試劑盒、BM2000 DNA Mark購自北京百泰克生物有限公司；引物合成及測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。儀器包括離心機、PCR儀、旋轉蒸發儀、美國Agilent 7890/5975型氣質聯用儀、Agilent色譜工作站、NIST 05譜庫等。

1.1.3 培養基 酵母液體培養基：酵母膏10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g，加水定容至1 000 mL。酵母固體培養基：酵母膏10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g，加水定容至1 000 mL。油脂培養基：蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、NaCl 5 g、香油10 g、1.6%中性紅水溶液1 mL、瓊脂20 g，加水定容至1 000 mL，pH 7.2。發酵液體培養基：蓖麻油5 mL、吐溫-80 0.2 g、市售麥芽粒20 g，加水定容至1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 產香菌株的分離和篩選 將天竺葵的葉片用無菌剪刀由葉柄端剪下接種于裝有30 mL已滅菌的酵母液體培養基的200 mL三角瓶中，置于28 ℃恒溫培養箱中富集培養2～3 d，待培養基變渾濁，樣品表面形成菌時將其進行梯度稀釋，涂布于新鮮的酵母固體培養基平板上，置于28 ℃恒溫培養，待長出菌落后進行純化培養并將其接種于發酵液體培養基中，置于28 ℃恒溫搖床培養3 d，通過嗅覺初步判斷發酵液是否產生香味，斜面保存菌種。

利用因pH改變而變色的化合物作為指示劑對產脂肪酶菌株進行篩選，先將分離、純化的菌株接種于酵母固體培養基平板中，置于28 ℃培養箱中恒溫培養3 d，進行菌種活化，待其生長后再將其接種于油脂培養基平板中，置于37 ℃培養箱中培養，待菌生長后觀察平板底層，如果出現紅色斑點則為陽性，說明有脂肪酶產生。

1.2.2 產香菌株的形態學觀察和18S rDNA鑒定

1）形態學觀察。將菌株接種于酵母培養基平板上，于28 ℃恒溫培養2 d。參考《真菌分類學鑒定手冊》[16]對菌落形態和顯微形態進行觀察。

2）DNA提取和ITS rDNA 序列PCR擴增。用酵母培養基平板培養TZK-1，待其生長后刮取并收集菌絲，根據He[17]SDS-CTAB法提取該菌株基因組總DNA，略有改進。以提取的總DNA為模板，用ITS通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行PCR擴增。采用2×Power Taq PCR Master Mix 試劑盒，擴增總體系50 ？滋L。反應體系：2×Power Taq PCR Master Mix 25 ？滋L，上、下游引物各2 ？滋L，DNA 11 ？滋L，ddH2O 10 ？滋L。擴增條件：94 ℃，3 min；94 ℃，40 s；55 ℃，40 s；72 ℃，1 min，共30個循環；72 ℃，10 min。PCR產物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將擴增的PCR產物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，測序結果在NCBI上進行BLAST比對，并用Bioedit軟件進行多序列比對，再提交序列至GenBank，獲取登錄號。

1.2.3 脂肪酶基因擴增及其序列分析 以提取的基因組總DNA為模板，根據脂肪酶高度保守序列的引物Z1、Z2（表1）對該基因進行PCR擴增， PCR擴增體系同上，采用2×Power Taq PCR Master Mix 試劑盒。擴增條件：94 ℃，3 min；94 ℃，1 min；52 ℃，45 s；72 ℃，1 min，30個循環；72 ℃，10 min，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測并對擴增的PCR產物進行測序。

根據測序結果在NCBI上對保守序列進行比對，選取同源性高的菌株，利用Clustal W2軟件對選取菌株進行比對，尋找保守序列。利用Primer 5.0軟件根據保守序列設計引物Z3、Z4（表1），對該菌脂肪酶基因進行PCR擴增， PCR擴增體系同上。反應條件：94 ℃，3 min；94 ℃，1 min；59 ℃，45 s；72 ℃，1 min 30 s，35個循環；72 ℃，10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測并對擴增的PCR產物進行測序。

根據測序得到的上述2次核苷酸序列拼接設計引物LAD1-1（表1），利用引物LAD1-1、Z2 PCR擴增該脂肪酶的全基因序列，PCR擴增體系同上。反應條件：94 ℃，3 min；94 ℃，1 min；52 ℃，45 s；72 ℃，1 min，30個循環；72 ℃，10 min，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測并將擴增的PCR產物送去測序。測序結果在NCBI上進行BLAST比對，利用BLAST搜索GenBank數據庫中與該序列同源性較高的菌株序列，采用Bioedit軟件進行多序列比對，利用軟件MEGA 5.0以Neighbor-Joining法構建產脂肪酶菌株的系統發育樹，Bootstrap值為1 000。

2 結果與分析

2.1 產香菌株的分離、篩選

利用酵母液體培養基對天竺葵的葉片進行富集培養，酵母培養基變渾濁，樣品表面有菌形成，將其進行梯度稀釋涂布于酵母固體培養基中培養，成功分離得到菌株，對其進行純化。再將分離、純化的菌株接種于發酵液體培養基中進行產香篩選，培養3 d后對其發酵液進行產香嗅覺初步判斷。結果發現，分離、純化得到的菌株能產生濃郁的甜酒香味，成功篩選得到一株產香菌株。將分離、純化的產香菌株命名為TZK-1。將TZK-1菌株接入油脂培養基平板培養，以篩選產生脂肪酶的菌株，經過37 ℃恒溫培養2 d觀察到TZK-1菌株平板底層出現紅色斑點，如圖1所示。由此可見，該菌株為脂肪酶產生菌。

2.2 產香菌株的形態學和18S rDNA鑒定

TZK-1菌株在酵母培養基培養2 d后，菌落圓形，質地疏松，菌絲由白色變為灰褐色；在顯微鏡下觀察到菌絲無隔膜，有假根，孢囊?；颗虼笮纬汕蛐捂咦幽?，孢囊孢子橢圓形，如圖2所示。參考真菌分類鑒定手冊，初步確定為根霉屬。以TZK-1菌株的DNA為模板，利用真菌通用引物ITS1/ITS4進行PCR擴增并對相應PCR產物進行測序。測序結果表明，該菌株長度為611 bp，將序列提交GenBank獲得登陸號為KJ755444。利用BLAST軟件將所得基因序列與NCBI數據庫的序列進行同源性比較分析，利用Bioedit進行多序列比對，結果見表2。分析結果表明，TZK-1菌株與Rhizopus oryzae（KF717370）菌株的同源性較高，達到99.6%，TZK-1菌株與米根霉可能具有共同的起源。

2.3 脂肪酶基因擴增及系統發育分析

以提取的TZK-1總DNA為模板，利用引物Z1、Z2進行脂肪酶基因PCR擴增，結果得到約400 bp的擴增產物，與預期結果一致。根據測序結果在NCBI上對保守序列進行比對，選取同源性高的菌株，利用Clustal W2軟件對選取的菌株進行比對，尋找保守序列。利用Primer 5.0軟件設計的引物Z3、Z4對該菌脂肪酶基因進行PCR擴增，結果得到約800 bp的擴增產物，與預期結果一致。

根據2次測序結果拼接核苷酸序列設計引物LAD1-1，利用引物LAD1-1、Z2擴增完整的目的基因，經測序、拼接得到完整的脂肪酶基因，該脂肪酶基因片段大小為1 108 bp，編碼369個氨基酸。經過3次PCR擴增，成功擴增得到脂肪酶基因，并利用凝膠成像系統觀察，結果如圖3所示。

將擴增得到的序列與GenBank數據庫中序列進行比對，選取比對的14組核苷酸序列進行系統發育分析，用軟件MEGA 5.0以Neighbor-Joining法構建產脂肪酶菌株的核苷酸系統發育樹，結果如圖4所示。結果表明，菌株TZK-1與Rhizopus oryzae（AF229435）和Rhizopus oryzae（JN689988）聚為一支，支持強度達到92%，同源性分別達到99.5%和96.6%，與其同源性最低的是Rhizopus microsporus var. chinensis（EF405962），同源性為55.6%，可以看出TZK-1脂肪酶在遺傳距離上與Rhizopus oryzae比較近，與Rhizopus microsporus var. chinensis較遠。

將擴增得到的米根霉脂肪酶基因序列翻譯成氨基酸序列后，利用MEGA 5.0軟件構建產脂肪酶菌株的氨基酸系統發育樹，結果如圖5所示。由圖5可知，菌株TZK-1與Rhizopus oryzae（AF229435）和Rhizopus oryzae（JN689988）聚類成一支，支持強度達到95%，同源性分別達到97.5%和96.1%，與其同源性最低的是Synthetic construct（GU475119），同源性為9.7%。由此可知，無論在核苷酸水平還是氨基酸水平上，擴增得到的脂肪酶都與Rhizopus oryzae脂肪酶具有較高的相似性，因此初步認為擴增得到的脂肪酶基因為米根霉脂肪酶基因。

3 小結與討論

米根霉脂肪酶具有高度的1、3位置特異性，可以水解和再合成三甘油酯的第一位酯鍵，可以用來水解、重組脂肪和油脂，在芳香酯、手性化合物、生物柴油等有機物的合成中具有較高價值。伴隨著脂肪酶的商業價值問題也是突出的，其中包括天然菌株產脂肪酶產量低，酶與菌體分離純化困難，產物純度達不到工業化生產要求等問題，因此利用分子生物學手段擴增脂肪酶基因作為一種高效表達的生產方法已經成為研究的熱點。

本研究從采集的香料植物天竺葵樣品中分離得到一株產脂肪酶菌株，通過對該菌進行形態學觀察和18S rDNA序列測定，測序結果表明該菌株與米根霉（Rhizopus oryzae）具有最高的遺傳相似性，再結合形態學可以確定該菌株為米根霉。通過PCR擴增該菌株脂肪酶基因和NCBI數據庫比對，發現擴增得到的脂肪酶基因與NCBI提交的Rhizopus oryzae（AF229435）和Rhizopus oryzae（JN689988）脂肪酶核苷酸和氨基酸序列具有著較高的同源性。說明本研究成功擴增得到全長為1 108 bp，編碼369個氨基酸的基因可能為米根霉脂肪酶基因，為挖掘我國的產脂肪酶微生物及其對脂肪酶的研究提供了材料。

TZK-1菌株在發酵培養基培養過程中，能產生濃郁的甜酒香味，這種香味的存在可能與菌株產生的某種或某些代謝產物有關，同時菌株代謝過程中產生的甜酒氣味可能與脂肪酶的存在有著某種聯系，這對米根霉產香化合物的發酵優化提供理論指導。探究該菌產香化合物的發酵優化及其產生的有關代謝產物組成，并對產香代謝化合物進行分離、提純將成為后期研究的內容。

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