乙酰胺對念珠藻 Nostoc 106生長周期的影響

摘要：研究了不同濃度的乙酰胺對念珠藻106（Nostoc sp. 106）在對數期、穩定期和生長末期的影響。研究結果表明加入一定濃度的乙酰胺對藍藻生長有一定的刺激作用。測定葉綠素a、藻膽蛋白含量、SOD含量、ATP含量等生長代謝指標，表明加入濃度為1、2和5 mg/mL的乙酰胺不同程度地延緩了念珠藻Nostoc sp. 106的衰亡，濃度5 mg/mL的乙酰胺增加了念珠藻Nostoc sp. 106在生長對數期的時間。

關鍵詞：乙酰胺；葉綠素a；藻藍蛋白；念珠藻106（Nostoc sp.106）

中圖分類號：Q945 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）07-1699-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.07.043

藍藻是水生生態系統中的重要組成部分，對整個水生態系統的平衡和穩定起著重要的作用。藍藻的大量生長惡化水體的通風及光照條件、抑制水體中浮游生物有益種類的生長繁殖、阻礙水中植物的光合作用，擠占其他水生生物的生存空間[1]。藍藻生命力強，越冬期生活在湖泊的底泥中，遇到適合其生長的外部環境條件如光照、溫度、溶解氧（DO）等時，再次復蘇[2]。念珠藻作為藍藻一個代表種，屬于水華爆發中的常見藻種。

近年來，有許多關于湖泊富營養化與藍藻爆發相互作用的報道，但就某類污染物對藍藻生長影響的具體研究較少。前期試驗發現工業廢水中的酰胺類物質可能是藍藻爆發與瘋長的原因之一。乙酰胺（acetamide）別名醋酰胺，是有機氟殺蟲農藥氟乙酰胺中毒的解毒藥，可用作對水溶解度低的一些物質在水中溶解時的增溶劑，如纖維工業中常用乙酰胺作染料的溶劑和增溶劑。因此隨著工業廢水的排放，每年有大量的乙酰胺進入湖泊、河流等自然水體中。本研究就乙酰胺對念珠藻106（Nostoc sp.106）生長周期的影響進行了研究，對比不同濃度的乙酰胺對念珠藻106（Nostoc sp.106）在對數期、穩定期和生長末期的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

藻種：念珠藻106（Nostoc sp.106）由中國科學院典型培養物保藏委員會淡水藻種庫（FACHB）提供。BG-11培養基，用以培養Nostoc sp.106。培養溫度為25 ℃， 可見光照度2 000 lx，pH 6.8，培養至對數生長期。

乙酰胺：由成都科龍化工試劑公司提供（分析純AR）。

其余所用試劑均為分析純（AR）。

試驗儀器：LRH-250型生化培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）、可見分光光度計721G（上海精密科學儀器有限公司）、JY92-Ⅱ型超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技有限公司）、高速臺式離心機。

1.2 乙酰胺對藍藻生長周期的影響試驗

分別將對數期的念珠藻106（Nostoc sp.106）接種于4個1 000 mL錐形瓶中，藻液接滿1 000 mL。1號為空白對照試驗，2號加入乙酰胺濃度為1 mg/mL，3號加入乙酰胺濃度為2 mg/mL，4號加入乙酰胺濃度為5 mg/mL。每天光照10 h、曝氣24 h、磁攪拌力器攪拌，試驗溫度25 ℃， pH 6.8，每隔24 h定點取樣分析。

1.3 葉綠素a（Chl a）的測定

每隔24 h定時取5 mL（定為V1）藻液于10 mL離心管中，在超聲破碎儀上破碎30 s，工作時間1 s，間隔2 s，然后在樣品中加入20 μL 1%（質量分數）的MgCO3溶液，于8 000 r/min下離心15 min，棄去上清液[3]。在沉淀中加入3 mL丙酮溶液，于4 ℃冰箱中過夜萃取18～24 h，于7 000 r/min下離心10 min，取上清液于7 mL離心管中，分別測定750，663，645 和630 nm的吸光度（OD），取7 mL離心管中上清液的體積為V2，利用下式計算Chl a （mg/mL）：

葉綠素a含量=[11.64×（OD663 nm-OD750 nm）-2.16×（OD645 nm-OD750 nm）+0.1（OD630 nm-OD750 nm）]V2/V1

1.4 藻藍蛋白（C-PC）含量的測定

參照Padula的方法[4]，在分光光度計下測量藻藍蛋白在620和650 nm的OD，用以下公式計算C-PC（mg/L）：

C-PC=（166×OD620 nm）-（108×OD650 nm）

1.5 藻密度的吸光度值

超聲破碎，用分光光度計（721G）在680 nm下測量藻液的吸光度值[5]。

1.6 超氧化物歧化酶（SOD）的測定

于25 ℃，在4.5 mL 50 mmol/L，K2HPO4-KH2PO4緩沖液中加入待測的樣品SOD粗酶液，再加入10 μL 50 mmol/L聯苯三酚，迅速搖勻，將搖勻的反應液立即倒入光徑為1 cm的比色杯內，分光光度計325 nm波長下每隔30 s測OD一次，要求連苯三酚的自氧化速率控制在 OD0.07/min左右，對照管取10 mmol/L HCl代替[6]。

測得數據按下式計算SOD活性（U/mL）：

SOD活性=[0.07-OD325 nm/min]/0.07×100%/50%×反應液總體積×樣液稀釋倍數/樣液體積。

1.7 ATP含量的間接測定法

采用間接測定的改進法[7]，取20 mL藻液，在8 000 r/min下離心10～15 min，棄去上清液，沉淀用少量蒸餾水溶解（2～3 mL）。將上述沉淀溶解液加入消解罐中，再向其中加入5 mL質量分數為95%的 濃硫酸。旋緊罐塞，在消解儀器中進行消解，消解完畢冷卻至室溫。然后旋開罐塞，向罐中加入1～2滴H2O2，搖勻，用蒸餾水稀釋至10 mL，此即為消化液。將上述消化液取3 mL加入25 mL的比色管中，在另一管中加3 mL蒸餾水為對照，再向兩管中均加入3 mL定磷試劑，同置于45 ℃水浴25 min。取出比色管冷至室溫，在722N型分光光度計上660 nm處比色測定OD（用OD反映ATP含量大小）。定磷試劑的配置：按體積比例，蒸餾水2份、質量分數為2.5%的鉬酸銨1份、質量分數為10%的抗壞血酸1份、質量分數為65.33%的硫酸1份，混合。

2 結果與討論

2.1 念珠藻106葉綠素a含量變化

葉綠素a是藍藻光合作用不可缺少的催化劑，其含量的多少直接反應了藍藻生長代謝的活性[8]（圖1）。加入乙酰胺濃度為1、2和5 mg/mL樣品的葉綠素a明顯高于空白樣。乙酰胺對念珠藻的生長有一定的促進作用。在對數初期，加入乙酰胺藻樣和空白藻樣區別不明顯。進入生長穩定期，空白藻樣和乙酰胺濃度為1、2 mg/mL的藻樣葉綠素a含量基本穩定，而乙酰胺濃度5 mg/mL的藻樣葉綠素a含量繼續保持增長，仍然處于生長對數期。由此可見，加入濃度5 mg/mL乙酰胺對念珠藻106（Nostoc sp.106）的生長產生一定的刺激作用。其生長對數期持續時間較空白樣品更長，其光合作用的速率較空白樣品更高，其細胞生長代謝活性較空白樣品更強，從而提高了藍藻水華爆發的概率。

2.2 乙酰胺對念珠藻106生長速度的影響

由圖2所示，加入乙酰胺濃度1、2和5 mg/mL的樣品藻密度比空白樣高。進入生長穩定期，加入乙酰胺濃度1、2 mg/mL的樣品藻密度區別不明顯。而加入5 mg/mL的樣品藻密度高于空白樣品57%，表明其藍藻個體數量較空白樣品多，所能占用的水生資源與營養比空白樣品多，為藍藻的大量繁殖生長提供了基礎。

2.3 乙酰胺對念珠藻106藻藍蛋白（C-PC）含量的影響

藻藍蛋白與葉綠素a在藍藻的光合作用中起著同等重要的作用，是藻類細胞中光合作用的一部分，將補獲的光能傳遞給葉綠素a[9]。

由圖3所示，進入生長末期，加入乙酰胺濃度為1、2和5 mg/mL樣品的藻藍蛋白含量與對照差異顯著，而濃度5 mg/mL乙酰胺樣品藻細胞內C-PC含量較高，體內活性蛋白較多，表明光合作用系統較完整。

2.4 乙酰胺對念珠藻106 SOD含量的影響

在葉綠體中，超氧自由基的清除是通過SOD酶來催化完成的，當這種清除體系遭到破壞時，導致 ·O2-積累，進而引起H2O2積累，導致膜脂質過氧化，從而破壞葉綠體結構，致使葉綠素含量下降，細胞生長受阻[10]。由圖4可見，在生長末期正常藍藻細胞體內的SOD含量減少了67%，細胞內的抗氧化系統不能保持平衡，藻細胞的死亡速度遠遠大于生長速度。而濃度5 mg/mL的乙酰胺藻樣SOD含量減少了43%， 基本能夠維持抗氧化功能。

2.5 乙酰胺對念珠藻106 ATP含量的影響

ATP可以指示微生物的生物量和活性。由圖5所示，濃度5 mg/mL的乙酰胺藻樣在生長末期ATP含量比對數期下降了70%，仍高于空白樣；而濃度1和2 mg/mL的樣品和對照樣區別不明顯。由此可見，濃度5 mg/mL的乙酰胺藻樣在生長末期的細胞活性要高于對照樣，延長了藍藻的生命周期。

3 結論

在生長對數期，加入濃度5 mg/mL的乙酰胺藻樣，藻密度、葉綠素a含量都高于同期空白樣品，乙酰胺對念珠藻106的生長有正面的刺激作用，延長了藍藻的生長對數期時間，提高了藍藻水華爆發的概率。

在生長末期，加入濃度5 mg/mL乙酰胺的藻細胞葉綠素a、C-PC、SOD和ATP含量都高于空白樣品，表明該濃度乙酰胺間接延緩了念珠藻106的衰亡，延長了藍藻正常生命周期的時間，提高了藍藻細胞的活性，增加了藍藻水華爆發的強度。

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