酸性染料比色法測定苦馬豆中總生物堿含量

摘要：采用酸性染料比色法測定苦馬豆[Swainsonia salsula Taubert（Sphaerophysa salsula （Pall.）DC.）]中總生物堿含量。以苦參堿為標準品，溴麝香草酚藍為染色液，在pH 7.6緩沖溶液中與生物堿反應，反應產物用氯仿萃取，萃取液于414 nm處測定其吸光度。應用建立的酸性染料比色法對寧夏不同地區采集的苦馬豆樣品中總生物堿含量進行分析。結果表明，苦參堿在0.001 7～0.013 3 μg/μL內與吸光度線性關系良好，回歸方程為y=50.549 0x-0.047 7（R2=0.999），苦參堿的平均回收率為103.17（RSD為1.70%），測得寧夏平羅縣、鹽池縣、銀川市采集的苦馬豆中總生物堿質量分數分別為0.026%、0.024%、0.017%。該方法靈敏、可靠、操作簡便，可用于苦馬豆中總生物堿含量的測定。

關鍵詞：苦馬豆[Swainsonia salsula Taubert（Sphaerophysa salsula （Pall.）DC.）]；酸性染料比色法；總生物堿；苦參堿

中圖分類號：R927.2；O657.32 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）07-1710-03

苦馬豆[Swainsonia salsula Taubert（Sphaerophysa salsula （Pall.）DC.）]是豆科苦馬豆屬草本植物，別名羊卵蛋、羊尿泡、尿泡草、紅花苦豆子等，廣泛分布于內蒙古、寧夏、甘肅、青海、新疆等地[1]。苦馬豆全草、果可入藥，民間用于治療腎炎、慢性肝炎、肝硬化腹水等疾病。苦馬豆含有黃酮、生物堿、異環烷、木脂素、酚酸、萜及甾醇類化合物[2]。目前對苦馬豆的總黃酮含量進行了深入分析，但總生物堿含量的研究尚未見報道。研究表明，苦馬豆中含有苦參堿[3]、苦馬豆堿（Spherophysine）[4]、苦馬豆素（Swainonine）[5]、麥角堿（Ergotine）[1]等多種生物堿，該類生物堿具有調節血壓、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、調節免疫、治療產后出血和帕金森病等作用[2，3，6]。因此，測定苦馬豆總生物堿含量可對苦馬豆的藥材質量評價和臨床應用提供重要的科學依據。苦馬豆也是一種有毒植物，家畜過量采食會導致中毒死亡[7]，給草原畜牧業造成嚴重的經濟損失，有報道生物堿可能是導致動物中毒的重要原因[4]，測定苦馬豆中生物堿的含量，也可為動物苦馬豆中毒的防控提供科學依據。

目前，用于植物樣品生物堿測定的方法有薄層色譜掃描法、高效液相色譜法（HPLC）、高效毛細管電泳法（HPCE）、重量法、酸堿滴定法、酸性染料比色法等。薄層色譜掃描法、高效液相色譜法、高效毛細管電泳法靈敏度高，測量準確，適用于對植物樣品中各生物堿組分的定量分析，但所需設備昂貴，操作復雜，技術要求較高，一般無法檢測在紫外可見光區吸收較弱或無吸收的化合物。而重量法、酸堿滴定法的靈敏度較低，誤差較大，一般用于總生物堿含量的粗略評估。酸性染料比色法是根據生物堿在一定pH介質中與酸性染料發生反應，形成可被紫外分光光度計檢測的具有生色基團絡合物的原理建立的方法，該方法具有靈敏度高、重現性好、操作簡便、樣品處理簡單等特點，近年來已廣泛用于苦參、苦豆子等中藥材中總生物堿含量的測定[8-12]。本研究擬以苦參堿為對照品，用酸性染料比色法，對寧夏不同地區采集的苦馬豆總生物堿含量進行測定，為苦馬豆藥材質量評價、臨床應用和動物苦馬豆中毒的防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物樣品 苦馬豆全草，采于寧夏平羅縣、鹽池縣和銀川市，采集后風干、粉碎備用。

1.1.2 主要試劑和儀器 苦參堿標準品購自中國食品藥品檢定研究院，生產批號為110805-200508；溴麝香草酚藍、甲醇、乙醇、氯仿、氨水、氯化銨等均為分析純。DU800型紫外分光光度計（美國貝克曼公司）。

1.2 方法

1.2.1 苦參堿標準品溶液的制備 標準品溶液的配制：精密稱取10.0 mg苦參堿標準品，用體積分數為50%乙醇定容于10 mL的容量瓶中，配制成1 mg/mL標準品溶液。

1.2.2 供試樣品溶液的制備 稱取苦馬豆草粉1.00 g，用濾紙包好后放入索式提取器，加入100 mL甲醇，80 ℃提取24 h，取出提取液，濃縮至干，殘渣用5 mL體積分數為2%乙酸溶液溶解。將乙酸溶液加入裝有5 g 732型陽離子交換樹脂（NH4+型）的分離柱中，靜置過夜后先加入去離子水洗脫樹脂，待洗脫液呈中性時，再用1 mol/L的氨水溶液洗脫，收集水洗脫液，濃縮至干，用1 mL乙醇溶解，離心后取上清液用體積分數為50%乙醇稀釋，備用。

1.2.3 最大吸收波長的確定 分別取標準品溶液20 μL、供試樣品溶液100 μL，分別加入具塞試管中，揮干溶劑后，每管中分別加入pH 7.6的質量體積分數為0.012 5%的溴麝香草酚藍溶液6 mL，氯仿6 mL，然后倒入分液漏斗中劇烈振蕩2 min，靜置2 h。取氯仿層溶液，置于紫外分光光度計中，在300～900 nm內掃描，測定其最大吸收波長。

1.2.4 標準曲線的繪制 取標準品溶液0、10、20、30、40、50、60、70、80 μL，分別加入9支具塞試管中并揮干溶劑，按“1.2.3”項下方法處理后，于紫外分光光度計測定其414 nm處的吸光度，以吸光度為縱坐標（y）、苦參堿濃度為橫坐標（x）繪制標準曲線，得出線性回歸方程并確定線性范圍。

1.2.5 穩定性試驗 取標準品溶液60 μL，加入具塞試管中并揮干溶劑，按“1.2.3”項下方法處理后，分別在0、1、2、3、4、6、8、10、12 h時測定其414 nm處的吸光度，根據線性回歸方程計算樣品含量，并計算相對標準偏差（RSD）。

1.2.6 精密度試驗 取5份標準品溶液，每份50 μL，加入具塞試管中并揮干溶劑，按 “1.2.3”項下方法進行處理，然后置于紫外分光光度計中測其414 nm處的吸光度，根據線性回歸方程計算樣品含量，并計算RSD。

1.2.7 加標回收試驗 稱取已知生物堿含量的苦馬豆樣品（266.34 μg/g）1 g，按“1.2.2”項下方法分別制備樣品溶液，將樣品溶液平均分為5份，加入苦參堿標準品溶液60 μL。將每份樣品溶液加入具塞試管中并揮干溶劑，按“1.2.3”項下方法處理后測其414 nm處的吸光度，根據線性回歸方程計算回收率，并計算RSD。

1.2.8 樣品含量的測定 精密稱取寧夏平羅縣、鹽池縣、銀川市采集的苦馬豆草粉各3份，每份1 g，按“1.2.2”項下方法制備供試樣品溶液，從每份樣品溶液中各取100 μL加入具塞試管中并揮干溶劑。按“1.2.3”項下方法處理后在414 nm處測定吸光度，根據線性回歸方程計算苦馬豆樣品中總生物堿的含量。

2 結果與分析

2.1 最大吸收波長

經測定，供試樣品溶液最大吸收波長分別在355和414 nm處有較強吸收，但414 nm處吸收最強（圖1）。苦參堿標準品溶液在414 nm處有最強吸收，故本試驗采用414 nm作為測定生物堿的吸收波長。

2.2 標準曲線的繪制

以苦參堿標準品溶液414 nm的吸光度為縱坐標（y），苦參堿濃度為橫坐標（x），繪制標準曲線，得到標準曲線方程為y=50.549 0x-0.047 7（R2=0.999），苦參堿檢測濃度在0.001 7～0.013 3 μg/μL內與吸光度線性關系良好。

2.3 穩定性、精密度及加標回收試驗

經測定，本方法穩定性試驗和精密度試驗的RSD分別為4.26%（表1）和5.29%（表2），說明該方法精密度較好，供試樣品溶液在12 h內較穩定。加標回收試驗結果如表3所示，平均回收率為104.31%，RSD為1.70%。表明系統誤差符合分析條件，測試結果準確度高，可靠性強。

2.4 樣品中生物堿含量的測定

測得寧夏平羅縣、鹽池縣、銀川市采集的苦馬豆樣品中生物堿質量分數分別為0.026%、0.024%和0.017%（表4）。

3 小結與討論

試驗結果表明，寧夏不同地區采集的苦馬豆樣品中總生物堿含量差異較大，其中寧夏平羅縣和鹽池縣采集的苦馬豆樣品中總生物堿含量較高，其生物堿質量分數分別為0.026%、0.024%，而銀川市采集的樣品中生物堿含量較低（0.017%）。苦馬豆廣泛分布于中國西北地區，不同的生長環境、氣候可能對其生物堿含量產生重要影響。因此，需進一步對我國不同區域苦馬豆中生物堿含量進行分析，從而為苦馬豆的開發利用提供科學依據。

楊毅恒[13]用苦參堿為標準品測定苦參藥材中生物堿的含量，在pH 7.6條件下，與溴麝香草酚藍絡合成可被氯仿萃取的有色離子對，在417 nm處有最大吸收，建立的方法專屬性強，結果準確可靠。在本試驗中，當緩沖溶液pH為7.6時，苦馬豆與溴麝香草酚藍絡合生成可被氯仿萃取的具有生色基團的化合物，在355和414 nm處均出現較大吸收峰，其中414 nm處吸收最強。而對照標準品苦參堿與酸性染料反應后，僅在414 nm處有最大吸收峰，故本試驗選擇414 nm作為苦馬豆總生物堿的檢測波長。經酸性染料處理的待檢溶液在12 h內較穩定，精密度較好，系統誤差較小，測試結果準確度較高，可靠性較強。表明該方法可用于苦馬豆總生物堿的定量分析，并測得寧夏平羅縣、鹽池縣、銀川市采集的苦馬豆中總生物堿質量分數分別為0.026%、0.024%和0.017%。

參考文獻：

[1] 江蘇省植物研究所.新華本草綱要（第二冊）[M].上海：上海科學技術出版社，1988.

[2] 于 婷，高新磊，韓 冰，等.苦馬豆化學成分及應用研究進展[J].內蒙古農業科技，2010（4）：93-95.

[3] 趙清梅，余永濤，馬永平.苦馬豆生物堿成分的初步分析[J].中國畜牧獸醫，2012，39（11）：135-139.

[4] RWBINSHTEIN M，MENSHIKOV G P. The alkaloids of Sphaerophysa salsula[J]. J Ger Chem， 1944（14）：161-171.

[5] 王 凱.綿羊苦馬豆中毒調查和診斷[J].中國獸醫科技，1998，28（5）：36-37.

[6] 盧春霞，王洪新.麥角生物堿的研究進展[J].食品科學，2010， 31（11）：282-288.

[7] 張勤文.羔羊苦馬豆中毒的臨床和病理學觀察[J].青海畜牧獸醫雜志，1998，28（6）：35.

[8]李建偉.酸性染料比色法測定苦參藥材中總生物堿的含量[J].長治醫學院學報，2007，21（5）：331-332.

[9] 馬朝陽.苦豆子生物堿提取分離純化研究[D].江蘇無錫：江南大學，2004.

[10] 嚴 敏，王玉鳳，湯洪敏.黔產艾納香生物堿的提取及含量測定[J].湖北農業科學，2014，53（10）：2336-2339.

[11] 盧 馨，劉文虎，曾 里，等.酸性染料比色法測定瑪咖總生物堿含量的方法研究[J].食品工業，2014，35（1）：241-243.

[12] 余永濤，何生虎，趙清梅.寧夏苦豆子中產苦參堿內生真菌的分離與鑒定[J].中國農業科學，2013，46（13）：2643-2654.

[13] 楊毅恒，翟所迪.酸性染料比色法測定鞣苦膠囊中苦參總生物堿的含量[J].北京中醫藥大學學報，2004，27（6）：63-65.