產生物表面活性劑石油降解菌Bacillus BS—8的生物學特性

摘要：研究石油降解菌BS-8（Bacillus sp.）的生長特性及影響其產生物表面活性劑的因素。通過測定BS-8發酵液的OD600 nm、表面張力、排油圈直徑推測其生物表面活性劑的產生方式；考察了碳源、氮源、溫度、pH、NaCl濃度對其產生物表面活性劑的影響。結果表明，菌株BS-8生物的表面活性劑產生方式為生長相關型，發酵液的表面張力隨菌體數量的增加而降低，排油圈直徑與發酵液中表面活性劑含量呈正相關；菌株BS-8高產生物表面活性劑的碳源、氮源分別為葡萄糖、酵母膏，最適培養溫度為30 ℃，最適pH 7.0，最適NaCl濃度為20 g/kg。

關鍵詞：生物表面活性劑；石油降解菌BS-8；生長相關型；生物學特性

中圖分類號：X53 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）07-1567-03

生物表面活性劑（Biosurfactants，簡稱BS）是由微生物在一定條件下代謝合成的分子結構中同時存在極性親水基和非極性疏水基，能夠顯著降低水溶液表面張力的一種次級代謝產物[1]。與化學合成的表面活性劑相比，具有用量少、選擇性好、低毒、可生物降解等優點，被廣泛應用于食品工業、化妝品工業、制藥工業以及環境工程等領域。許多利用微生物修復石油污染的研究表明，生物表面活性劑起到了非常重要的作用[2]。研究發現，培養基中的營養條件（如C、N、P濃度）和培養條件（如pH、溫度、離子強度、接種量、種齡等）對微生物產表面活性劑都有不同程度的影響，碳源對微生物所產表面活性劑的產量和結構有決定作用，烴類物質的存在尤其是烴鏈長度對培養基中微生物所產表面活性劑的濃度也會有著顯著的影響[3]。所以，篩選高產生物表面活性劑的菌株及對影響代謝產物的因素研究具有極其重要的意義。課題組從長期受石油污染的土壤中篩選到一組產生物表面活性劑的菌株，對其中一株高產生物表面活性劑的菌株的生長與產表面活性劑的關系進行了研究，并對影響其產表面活性劑的因素進行了探討，為提高生物表面活性劑的發酵產率及開發應用打下一些理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 菌株BS-8（Bacillus sp.），從長期受石油污染的土壤中篩選到[4]。

1.1.2 培養基 LB培養基（g/L）： 胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，瓊脂20；pH 7.0。

發酵培養基（g/L）：葡萄糖 20.0，（NH4）2SO4 2.0，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO4 2.0，Na2HPO4 2.0，CaCl2·H2O 0.005；pH 7.0～7.2

1.2 方法

1.2.1 測定方法 排油圈的測定參考王大威等[5]的方法，表面張力的測定參考曹娟等[6]的方法。

1.2.2 菌株BS-8的生長與產表面活性劑的動態關系試驗 將菌株BS-8以10%的接種量接種到發酵培養基中，30 ℃、160 r/min振蕩培養，每隔6 h取樣，用紫外分光光度計測定發酵液的OD600 nm，并測定離心后的發酵上清液的表面張力及排油圈直徑。

1.2.3 影響菌株BS-8產表面活性劑的因素試驗 微生物的生長需要充足的碳源、氮源等營養物質，還需要合適的培養條件如溫度、pH、滲透壓等。為確定菌株BS-8的最佳生長及產表面活性劑的條件，研究了碳源、氮源、溫度、pH和NaCl濃度對菌株產表面活性劑的影響。按照5%的接種量，將菌株BS-8于30 ℃、160 r/min搖床培養48 h，并測定離心后的發酵上清液的排油圈直徑。具體設計見表 1。

2 結果與分析

2.1 菌株BS-8產表面活性劑與菌體生長的動態關系

菌株BS-8在發酵培養基中振蕩培養，定時取樣，測定發酵液的OD600 nm及離心上清的表面張力和排油圈直徑，結果如圖1所示。有研究表明，生物表面活性劑是細菌細胞生長過程中產生的代謝產物，其產生與菌體生長有相關型和非相關型兩類[7]。一定濃度范圍內，發酵液中表面活性劑的含量與表面張力呈反比[8]。發酵液的表面張力反映了菌株產表面活性劑的能力。圖1表明，在發酵培養基中菌株在6 h時已開始產表面活性劑，6～30 h內菌體數量迅速增加，發酵液的表面張力隨菌體數量的增加而降低，表面張力快速下降（從63.2 mN/m下降為39.4 mN/m）。隨著菌體數量緩慢增長，表面張力持續下降但降速減慢。30～54 h間細菌數量達到最高值，發酵液的表面張力也降至最低值34.1 mN/m。54～72 h間，菌體數量有所下降，表面張力有所增加。

排油圈直徑與發酵液中表面活性劑含量呈正相關，與表面張力呈負相關，即表面張力越大，排油圈直徑越小。由圖1可知，6～30 h上清液的表面張力快速下降，而排油圈直徑從11 mm增大到62 mm，隨著培養時間的增加，上清液表面張力持續下降但降速減慢，排油圈直徑維持在62 mm左右。據以上分析，推測菌株BS-8的表面活性劑產生方式為生長相關型。

2.2 不同因素對菌株BS-8產生表面活性劑的影響

2.2.1 菌株BS-8產表面活性劑的最適碳源 碳源是菌體生長和產生代謝產物必不可少的營養基質，充足的碳源決定了菌株產表面活性劑的產量。分別以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉作為發酵培養基中的碳源，經過48 h的培養，測定各發酵液的排油圈大小。從圖2可知，以葡萄糖為碳源時，排油圈直徑最大達到62 mm，其他幾種碳源產生的排油圈均小于以葡萄糖為碳源產生的排油圈。即葡萄糖為碳源的發酵培養液中生物表面活性劑的含量最高，所以培養液的碳源選擇葡萄糖。

2.2.2 菌株BS-8產表面活性劑的最適氮源 分別以硫酸銨、牛肉膏、酵母膏、尿素、硝酸銨作為發酵培養基中的氮源，經48 h的培養，測定發酵液的排油圈大小。圖3數據表明，不同的氮源對菌株BS-8產表面活性劑的量有較大的影響。以酵母膏為氮源時，排油圈直徑最大達到66 mm，均大于其他幾種氮源產生的排油圈，幾種氮源的效果大小順序為酵母膏、牛肉膏、硫酸銨、硝酸銨、尿素。

2.2.3 菌株BS-8產表面活性劑的最適溫度 菌株BS-8在不同溫度下培養，發酵上清液產生的排油圈大小也不同，說明溫度對菌株產表面活性劑的能力有一定的影響。由表2可知，在20～40 ℃的范圍內菌株BS-8的排油圈直徑較大，60 ℃時仍具有產表面活性劑的能力，說明該菌株具有較廣的生長溫度范圍。當培養溫度為30 ℃時，排油圈直徑達到67 mm。

2.2.4 菌株BS-8產表面活性劑的最適pH 菌株BS-8接種在不同pH的培養液中，經振蕩培養，其產表面活性劑的能力如表3所示。不同pH下，發酵上清液產生的排油圈大小不同，說明pH影響菌株產表面活性劑的能力。由表3可知，菌株BS-8在pH 6.0～9.0范圍內排油圈直徑較大。當pH為7.0時，排油圈直徑最大達到65 mm，發酵液中表面活性劑的含量最高。

2.2.5 菌株BS-8產表面活性劑的最適NaCl濃度 菌株BS-8在不同NaCl濃度的發酵液中培養，其產表面活性劑的能力如表4所示。由表4可知，發酵培養基中不同濃度的NaCl對菌株產表面活性劑的產量有較大影響，菌株BS-8在NaCl濃度為10～30 g/kg 的范圍內均生長良好，能耐受濃度50 g/kg的NaCl， 當NaCl濃度為20 g/kg時，排油圈直徑最大。

3 結論與討論

對生物表面活性劑的特性研究表明，其適用于石油工業和環境工程，因此生物表面活性劑的研究與開發逐漸成為國內外的研究熱點[9]，生物表面活性劑的生產方法主要有微生物發酵法和酶催化法兩種。根據微生物的種類和目標產物的不同將發酵法分為四種：生長細胞法、代謝控制的細胞生長法、休止細胞法和加入前體法[10，11]。目前只有少數產品走向市場，主要原因是生物表面活性劑的生產成本較高。通過選育高產菌株、改進發酵工藝及提高生物表面活性劑的產率可以降低其成本，使其走向大規模工業化生產。菌株BS-8（Bacillus sp.）是從長期受石油污染的土壤中篩選到的高產生物表面活性劑的菌株，對其生長與產表面活性劑的關系進行了研究，并對影響其產表面活性劑的因素進行了探討。菌株BS-8產表面活性劑與菌體生長的動態關系表明，菌株BS-8的表面活性劑產生方式為生長相關型，排油圈直徑與發酵液中生物表面活性劑含量正相關，與表面張力負相關。以排油圈直徑表征發酵液中生物表面活性劑的含量，不同因素影響了菌株產表面活性劑的能力，菌株BS-8高產表面活性劑碳源、氮源分別為葡萄糖、酵母膏，最適培養溫度30 ℃，最適pH 7.0，最適NaCl濃度為20 g/kg。

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