Ca2+ 對低溫脅迫下蘿卜幼苗逆境指標的影響

摘要：以蘿卜（Raphanus sativus L.）幼苗為材料，研究外源Ca2+ 對低溫脅迫下蘿卜幼苗逆境指標可溶性糖、丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）含量、過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響。結果表明，在低溫脅迫下，MDA、可溶性糖以及Pro的含量明顯上升，SOD和POD活性先下降再上升。用不同濃度的Ca2+處理后，可溶性糖和MDA的含量相對對照組在處理后的第1天有所下降，而Pro的含量增加，POD和SOD的活性變化則與處理的時間有關。用適當濃度的Ca2+處理可以增強蘿卜幼苗對低溫的抗性，降低低溫對蘿卜幼苗的傷害。

關鍵詞：低溫脅迫；Ca2+；逆境指標；蘿卜（Raphanus sativus L.）幼苗

中圖分類號：S631.1；Q945.78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）07-1612-06

低溫對植物的毒害效應，按低溫程度和受害情況，可分為冷害和凍害。冷害是指溫度在零攝氏度以上時，雖無結冰現象，仍能使喜溫植物受害甚至死亡，即零攝氏度以上的低溫對植物的傷害。冷害是喜溫植物北移的主要障礙，是喜溫作物穩產高產的主要限制因子。

近年來發現，低溫引發的細胞內Ca2+水平升高，在抗寒鍛煉中起著十分重要的作用。Ca2+充當低溫信號的傳遞信使，啟動抗寒鍛煉，誘導抗寒基因的表達[1-4]。利用水母發光蛋白的轉基因植物測定Ca2+濃度等研究揭示和證實，低溫條件下由于質膜上電壓門控Ca2+通道的開放而導致了Ca2+的流入[5]。植物細胞膜感受到低溫后，將低溫信號通過Ca2+、ABA（脫落酸）等第二信使繼續向下游傳遞，其中Ca2+是低溫信號轉導時重要的第二信使[6]。張國增等[7]在研究低溫脅迫下擬南芥CBF1超表達突變體胞質中Ca2+濃度的變化時發現，Ca2+參與了CBF1應答低溫信號的轉導過程，且CBF1超表達突變體可能是通過提高胞質Ca2+的濃度來提高植物的抗低溫脅迫能力。由此看來，Ca2+作為胞內的第二信使在低溫脅迫下發揮著調控細胞的重要功能。

Ca2+不僅在增強植物抵抗非生物逆境時具有重要作用，它在增強植物抗生物逆境如抗病防衛反應中也有重要作用[8]。為此，試驗通過測定CaCl2處理后蘿卜（Raphanus sativus L.）幼苗的丙二醛（MDA）、可溶性糖和脯氨酸（Pro）濃度變化以及過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）的活力變化，探討外源鈣離子（Ca2+）提高植物抵抗低溫脅迫以及其他脅迫的積極作用，旨在為進一步研究Ca2+增強植物抗逆性的機理提供依據。

1 材料與方法

1.1 種子來源

富農正宗圓紅蘿卜，由蘇州種子公司提供。

1.2 蘿卜幼苗的培養和試驗處理

1.2.1 蘿卜幼苗的培養 將蘿卜種子用60～70 ℃的去離子水清洗數次，倒去漂浮的種子并將爛種、雜種挑去。淘洗后置于干凈的培養皿中待用。將種子播于底部放置濕濾紙的培養皿中，每個培養皿中放一定量的種子，然后在種子上方覆蓋1張濕濾紙，加少量的去離子水（半浸沒種子），蓋好培養皿。最后置于25 ℃的恒溫箱中催芽。等到芽苗長至2～3 cm時撤掉上方濾紙，置于光照培養室中加完全培養液[9]進行培養，當幼苗莖長至10 cm左右時將所有幼苗轉移到培養瓶中，瓶壁避光。待幼苗長出第3片真葉時即進行脅迫試驗。在蘿卜幼苗的水培期間要保證培養液充足，并保持清潔。

1.2.2 試驗處理

1）溫度的選擇。參考文獻[10]和[11]，確定以5 ℃作為試驗的處理溫度。

2）試驗處理。將蘿卜幼苗分組，A——利用完全培養液培養；B——5 mmol/L CaCl2完全培養液培養；C——10 mmol/L CaCl2完全培養液培養；D——15 mmol/L CaCl2完全培養液培養，置于5 ℃、光照度33%、白天14 h、晚上10 h的恒溫培養箱中；另取適量幼苗置于25 ℃、光照度33%、白天14 h、晚上10 h的恒溫培養箱中，作為常溫對照，試驗期間保證幼苗水培營養液充足。然后在培養1、2、3、4、5 d時分別測定兩組幼苗的可溶性糖、MDA、Pro含量以及POD和SOD活性[11]。

1.3 指標測定及方法

可溶性糖、MDA、Pro含量，POD、SOD活性的測定參考文獻[9]和[12]進行。試驗數據采用統計軟件SPSS 11.0進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫對蘿卜幼苗逆境指標的影響

2.1.1 5 ℃和25 ℃下蘿卜幼苗葉片中可溶性糖含量的變化 在5 ℃和25 ℃下分別測得蘿卜幼苗葉片中1、2、3、4、5 d后可溶性糖含量的變化如圖1所示。從圖1可以看出，與對照相比，在低溫（5 ℃）條件下時，蘿卜幼苗葉片中的可溶性糖含量明顯上升。

2.1.2 5 ℃和25 ℃下蘿卜幼苗葉片中MDA含量的變化 在5 ℃和25 ℃下分別測得蘿卜幼苗葉片中1、2、3、4、5 d后MDA含量變化如圖2所示。從圖2可以看出，在低溫（5 ℃）條件下時，蘿卜幼苗葉片中的MDA含量前3 d高于對照，但在處理后的第4、5天低于對照。

2.1.3 5 ℃和25 ℃下蘿卜幼苗葉片中Pro含量的變化 在5 ℃和25 ℃下分別測得蘿卜幼苗1、2、3、4、5 d后Pro含量的變化如圖3所示。從圖3可以看出，在低溫（5 ℃）條件下時，蘿卜幼苗葉片中的Pro含量明顯上升，只是在處理后的第1天其Pro含量低于對照。

2.1.4 5 ℃和25 ℃下蘿卜幼苗葉片中POD活性的變化 在5 ℃和25 ℃下分別測得蘿卜幼苗葉片中1、2、3、4、5 d后POD活性的變化如圖4所示。從圖4可以看出，與對照相比，在低溫（5 ℃）條件下時，蘿卜幼苗葉片中的POD活性明顯下降，但其活性呈現出隨時間延長先上升再下降再上升的趨勢。

2.1.5 5 ℃和25 ℃下蘿卜幼苗葉片中SOD活性的變化 在5 ℃和25 ℃下分別測得蘿卜幼苗葉片中1、2、3、4、5 d后SOD活性的變化如圖5所示。從圖5可以看出，與對照相比，在低溫（5 ℃）條件下時，蘿卜幼苗葉片中的SOD活性明顯低于對照，其活性呈現出隨時間先下降再上升的趨勢。

2.2 不同濃度的Ca2+處理對低溫脅迫下蘿卜幼苗逆境指標的影響

2.2.1 不同濃度的Ca2+處理對低溫脅迫下蘿卜幼苗葉片中可溶性糖含量的影響 低溫脅迫下導致植物可溶性糖含量發生變化，利用不同濃度的Ca2+處理后蘿卜幼苗葉片內可溶性糖含量的變化如圖6所示。由圖6可以看出，低溫脅迫下只用完全培養液培養蘿卜幼苗時，其可溶性糖含量隨著時間先下降再上升再下降，而用不同Ca2+處理后，其可溶性糖的含量在第1天比未經Ca2+處理的要低，但隨著時間的延長，其可溶性糖含量不斷增加。但隨著Ca2+濃度的增加，其可溶性糖含量降低，在Ca2+濃度為15 mmol/L時，可溶性糖含量較其他處理低。

2.2.2 不同濃度的Ca2+處理對低溫脅迫下蘿卜幼苗葉片中MDA含量的影響 低溫脅迫下導致植物MDA含量發生變化，利用不同濃度的Ca2+處理后蘿卜幼苗葉片中MDA含量的變化如圖7所示。由圖7可以看出，低溫脅迫下只用完全培養液培養蘿卜幼苗時，其MDA含量隨著時間先下降再上升，但其上升的時間相對滯后。用不同濃度的Ca2+處理后，其MDA的含量在第1天比未經Ca2+處理的要低，但隨著時間的延長，其MDA含量比未經Ca2+處理的要高。Ca2+濃度為10 mmol/L時，MDA含量較其他處理低。

2.2.3 不同濃度的Ca2+處理對低溫脅迫下蘿卜幼苗葉片中Pro含量的影響 低溫脅迫下導致植物Pro含量發生變化，利用不同濃度的Ca2+處理后蘿卜幼苗葉片中Pro含量的變化如圖8所示。由圖8可以看出，低溫脅迫下只用完全培養液培養蘿卜幼苗時，其Pro含量隨著時間的推移逐漸上升，但其上升的幅度較小。用不同Ca2+處理后，其Pro的含量比未經Ca2+處理的要高，且隨著時間的推移，其Pro含量升高的幅度比未經Ca2+處理的要大，且呈現先下降再升高的趨勢。Ca2+濃度為5 mmol/L時，Pro含量較其他處理低。

2.2.4 不同濃度的Ca2+處理對低溫脅迫下蘿卜幼苗葉片中POD活性的影響 低溫脅迫下導致植物POD活性發生變化，利用不同濃度的Ca2+處理后蘿卜幼苗葉片中POD活性的變化如圖9所示。由圖9可以看出，低溫脅迫下只用完全培養液培養蘿卜幼苗時，其POD活性隨著時間的延長先上升再下降再上升。用不同濃度Ca2+處理后，其POD活性比未經Ca2+處理的要低；當Ca2+濃度大于5 mmol/L時，隨著時間的推移，其POD的活性整體呈上升趨勢。在Ca2+濃度為5 mmol/L時，POD活性較其他處理的要高，當Ca2+濃度為15 mmol/L時，POD活性較其他處理低。且在處理后的第4天各組（除處理A外）的POD活性達最大值。

2.2.5 不同濃度的Ca2+處理對低溫脅迫下蘿卜幼苗葉片中SOD活性的影響 低溫脅迫下導致植物SOD活性發生變化，利用不同濃度的Ca2+處理后蘿卜幼苗葉片中SOD活性的變化如圖10所示。由圖10可以看出，低溫脅迫下只用完全培養液培養蘿卜幼苗時，其SOD活性隨著時間的延長先下降再上升。用不同濃度Ca2+處理后，蘿卜幼苗葉片中SOD活性基本表現為隨著時間的延長先下降再升高。在Ca2+濃度為15 mmol/L時，SOD活性隨著時間的延長較其他處理高，在處理后的第4天其SOD活性達到最大。

3 小結與討論

3.1 Ca2+對低溫脅迫下蘿卜幼苗逆境指標的影響

3.1.1 對低溫脅迫下蘿卜幼苗葉片中可溶性糖和MDA含量的影響 低溫傷害不僅破壞植物的細胞代謝，而且導致體內生理功能發生變化，自由基的增加傷害膜系統，引發了細胞膜脂過氧化作用，最終產物MDA可以擴散到其他部位[13]。因此MDA的含量與植物衰老及逆境傷害有密切關系，一定程度上反映了植物受損傷的程度。在對蘿卜幼苗進行低溫處理時，蘿卜幼苗葉片中可溶性糖的含量比常溫（25 ℃）條件下的要高。而蘿卜幼苗葉片中MDA的含量在低溫處理后的前3 d都要比常溫條件下的MDA含量要高，但隨著處理時間的延長，蘿卜幼苗葉片中MDA含量較常溫下要低。究其原因，可能與常溫條件下蘿卜幼苗大量消耗水分，完全培養液的濃度一定程度上會升高，對蘿卜幼苗根部造成了脅迫，導致其MDA含量隨著處理時間的延長而增加。

蘿卜幼苗在經不同濃度Ca2+處理后的第1天，測得其可溶性糖和MDA含量比未經Ca2+處理的蘿卜幼苗要低。即在一定程度上緩解了低溫對蘿卜幼苗的傷害，但隨著處理時間的延長，經Ca2+處理的蘿卜幼苗可溶性糖和MDA含量比未經Ca2+處理的蘿卜幼苗要高，猜測出現這一結果可能是因為在低溫脅迫下，短時施用外源的Ca2+可以迅速增加植物細胞內的Ca2+含量，引發細胞內的信號反應，幫助細胞度過危機。但隨著外源Ca2+處理時間的延長，低溫所造成的植物細胞內的滲透脅迫由于額外的鈣離子鹽進一步加強了其滲透脅迫，因此利用不同濃度的Ca2+處理后的蘿卜幼苗中可溶性糖和MDA含量在處理后的第2天開始迅速增加。同時還發現，在利用Ca2+處理后的第1天，隨著Ca2+濃度的增加，蘿卜幼苗所產生的可溶性糖和MDA含量越少，也就是蘿卜幼苗受低溫脅迫程度越小。這也許可以通過低溫誘導細胞內Ca2+增加的時空特征不同來解釋，Campbell等[14]利用煙草幼苗在逐步降溫的過程中發現，根和植物地上部分表現出敏感性不同，當溫度從25 ℃降到17～18 ℃時，引發根細胞質基質Ca2+水平的升高；當溫度進一步降低到10 ℃時，則在子葉中觀察到細胞質基質的Ca2+增加；當溫度降到2 ℃時，根終止了反應，但子葉仍在繼續。總之，無論是煙草還是擬南芥，均表現為根在較高溫度下發生反應，地上部分則在較低溫度下發生反應[15]。由此可見，出現如此結果不僅與處理時所使用的不同的Ca2+濃度有關，還與植物自身組織差異有關。

3.1.2 對低溫脅迫下蘿卜幼苗葉片中Pro含量的影響 在逆境脅迫下（旱、熱、冷、凍），植物可通過積累一定量的溶質降低水勢，維持植物體內的水分平衡，保證植物的正常生長。這類物質包括一系列的含氮化合物，如Pro、多胺等，分布最廣的是Pro[16]。Pro積累的原初部位主要是葉，通過兩條途徑合成，即谷氨酸途徑和鳥氨酸途徑。Pro在滲透調節方面的作用，一是作為細胞質的滲透調節物質，二是作為防脫水劑。它是無毒的中性溶質，也是水溶性最大的一種氨基酸。在一定的干旱范圍內，許多植物是通過滲透調節作用來維持細胞一定的含水量和膨壓，從而維持細胞的正常功能。當對蘿卜幼苗進行低溫處理時，其Pro的含量較常溫條件明顯升高。利用不同濃度的Ca2+處理后，各處理蘿卜幼苗中的Pro含量比未用Ca2+處理的要高。從彭志紅等[15]描述的植物Pro的合成途徑中發現，Pro的合成并未受Ca2+信號途徑的調節，因此，在這里使用不同濃度的鈣鹽處理反而加強了蘿卜幼苗的滲透脅迫。

3.1.3 對低溫脅迫下蘿卜幼苗葉片中POD、SOD活性的影響 POD是防止膜脂過氧化的主要酶，在低溫脅迫下能夠保持膜的完整性。SOD的作用是清除超氧自由基，同時產生歧化產物過氧化氫。POD保護酶系統主要起酶促降解過氧化氫的作用，避免因過氧化氫的過量積累導致毒性更大的·OH-含量增加而對細胞膜產生傷害[17]。在對蘿卜幼苗進行低溫處理時，蘿卜幼苗的POD活性先上升再下降再上升；蘿卜幼苗的SOD活性先下降再上升，而無論是POD還是SOD的活性總體上都比常溫條件下的要低。經過不同濃度的Ca2+處理后的蘿卜幼苗葉片中的POD活性比只進行低溫處理的蘿卜幼苗葉片中的POD活性要低，在處理的第1天，用5 mmol/L Ca2+處理后的蘿卜幼苗POD活性下降得最少。在處理的第1天利用5 mmol/L Ca2+處理后的蘿卜幼苗SOD活性比只進行低溫處理的蘿卜幼苗SOD活性要高，且處理的第4、5天15、10 mmol/L Ca2+處理蘿卜幼苗葉片中SOD活性分別達到峰值。

3.2 Ca2+對低溫脅迫下蘿卜幼苗逆境指標影響的機制探究

低溫對植物組織的傷害大致分為兩個步驟：第一步為膜相的改變，膜從液晶態轉變為凝膠態，使膜透性劇增；第二步是由于膜損壞而引起代謝紊亂，導致死亡。脂肪酸能直接提高膜的流動性，也能直接影響膜結合酶的活性。在低溫脅迫下，MDA、可溶性糖和Pro含量都有明顯變化[17]。此外，植物的抗寒性與活性氧代謝關系密切，低溫脅迫下植物體內會產生大量的H2O2、O■■·、·OH-等活性氧自由基，這些活性氧可導致膜脂過氧化，進而造成膜系統的氧化損傷[18]。而植物體內存在著一系列酶促和非酶促的抗氧化劑以清除活性氧自由基，保護植物細胞免受活性氧的傷害，維持膜系統的穩定性，以增強植株的抗寒力。SOD、POD等被認為是清除活性氧過程中最主要的抗氧化酶類，SOD的主要功能是清除O■■·并產生H2O2，而POD可以清除體內的H2O2，二者協作及時清除自由基，有利于維持植物體內的活性氧代謝平衡，從而使植物能在一定程度上忍耐、減緩或抵抗低溫脅迫[19]。

施用外源Ca2+能減少植物體內有害物質的積累，增加有利物質的合成，提高細胞膜的保護功能，抑制活性氧在植物體內積累，大大提高生物對不良環境的抵抗力，提高植物的抗逆性。對于其機制目前有以下幾點猜測：①冷馴化中先啟動Ca2+信使，再通過調節蛋白質磷酸化而誘導與冷相關的基因表達，因而細胞的抗冷性增強；②鈣信號通過激活CDPK而活化脅迫誘導的啟動子，從而調控相應基因表達；③鈣信號通過調節一些蛋白質或酶活性而引發有利于植物適應逆境的生理生化反應，如激活CDPK而調節蛋白磷酸化、通過調節抗氧化酶的活性提高植物的抗氧化性、調節氣孔啟閉、促進相溶性物質脯氨酸合成、參與離子的選擇吸收，以及參與ABA的信號轉導和植物的交叉保護等[20]。Ca2+不僅是大量營養元素，而且是重要的第二信使，調控植物生長發育的很多過程如光形態建成、向地性、細胞分化等。同時質膜的透性和穩定性也與Ca2+有密切關系。

植物對逆境信號的感受是通過多條信號通路完成的，包括鈣信號轉導通路、ABA信號轉導通路、MAPK級聯信號通路等，各條通路之間相互交叉、相互影響，共同完成植物對逆境的適應[21]。其中，鈣信號被認為是各個級聯信號途徑中的交叉節點，而這個網絡中有很多過程還沒有被闡明。但是隨著分子生物學、遺傳學等學科的發展和新技術的產生，人們一定會對鈣信號的作用進行更深入的研究。

利用CaCl2處理的蘿卜幼苗雖未避免低溫脅迫引起的傷害，但程度已明顯減輕，這反映出適當濃度的鈣具有增強植物對低溫脅迫耐受性的生理作用。但是通過本試驗所測得的試驗數據發現，這種耐受性加強作用只是在一定的時間范圍內的，且利用Ca2+處理對不同的逆境指標的影響不同。例如處理后可溶性糖和MDA含量在一定時間范圍內有所下降，而Pro的含量卻比只進行低溫處理的含量要高，這都在一定程度上降低了低溫脅迫對植物的傷害。

研究結果表明，在低溫脅迫下，蘿卜幼苗的可溶性糖、MDA以及Pro的含量明顯上升，POD和SOD活性先下降再上升。低溫脅迫下，用10 mmol/L CaCl2處理蘿卜幼苗后的第3天，可減少可溶性糖、膜脂過氧化產物MDA的積累，但用CaCl2處理后蘿卜幼苗Pro的積累增加。當用10 mmol/L的CaCl2和完全培養液處理蘿卜幼苗后的第3天，SOD活性開始明顯上升，而在處理后的第1天和第2天，蘿卜幼苗的POD活性比只進行低溫處理的要低。這說明適當濃度的Ca2+處理能誘導蘿卜幼苗對低溫脅迫產生抗性，減輕低溫對蘿卜幼苗的傷害。

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