銀杏MECT基因啟動子克隆及序列分析

摘要：以前期獲得的銀杏（Ginkgo biloba L.）MECT基因的cDNA序列為模板，通過設計特異性引物及采用染色體步移的方法從銀杏基因組中克隆到GbMECT翻譯起始位點上游982 bp的啟動子序列，研究銀杏MECT基因啟動子的結構及功能特點。生物信息學分析結果表明，該啟動子序列中含有多種類型的順式作用元件，主要有典型的光響應調節元件、激素響應調控元件、抗病蟲害響應元件TGTCA序列、抗損傷應答元件ERF3和熱激響應元件HSE等。此外，在該啟動子片段中還含有氧脅迫和銅離子響應元件、淀粉酶響應元件等其他類型的作用元件，充分體現了啟動子對基因表達調控具有轉錄水平上的高效性和復雜性的特點。

關鍵詞：銀杏（Ginkgo biloba L.）；染色體步移；2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸胱氨酰轉移酶基因；調控元件

中圖分類號：S792.95 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）07-1746-05

在銀杏（Ginkgo biloba L.）萜內酯合成的MEP途徑中，MECT （2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate Cytidyltransferase，MEP cytidyltransferase）是其第三步反應的催化酶，催化2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸（2-C-methyl-D-erythritol-4-ohosphate， MEP）形成4-（胞苷5-焦磷酸）-2C-甲基赤蘚糖[4-（cytidine 5-diphospho）-2C-methyl-D-erythritol，CDP-ME]，并最終形成合成萜內酯的前體物質，因此MECT是調控萜類物質合成的一個關鍵酶。目前，已經從銀杏（Ginkgo biloba.L）[1]、擬南芥（Arabidopsis thaliana）[2]、玉米（Zea mays）[3]、番茄（Lycopersicon esculentum）[4]、水稻（Oryza sativa）[5]、大豆（Glycine max）[6]、火炬松（Pinus taeda）[7]等多種植物中克隆了MECT基因。

研究發現，在DNA水平上，銀杏MECT基因與擬南芥和水稻MECT基因相似度分別達到了70.7%和70.2%。盡管已從多種植物中獲得MECT基因的cDNA序列，但目前關于該基因啟動子表達調控方面的研究報道較少，尤其缺乏對該基因啟動子的基本結構和功能分析方面的探究，本試驗通過染色體步移法克隆銀杏MECT基因的啟動子，初步分析該啟動子所含的調節元件和作用特點，旨在為啟動子下一步的功能分析提供可靠依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

銀杏幼葉采自黃岡師范學院銀杏苗圃園，品種為家佛手14年生實生苗。采后自封袋封裝，于-80 ℃冰箱中冷凍保存。試驗所用大腸桿菌（Escherichia coli）菌株Top10為經濟林木種質改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室保存。

1.2 試驗試劑

各種限制性內切酶、ExTaq DNA聚合酶、PCR產物克隆載體pMD18-T Vector、dNTP、DL2000、T4 DNA Polymerase和T4 DNA Ligase均購自大連寶生物工程有限公司；DNA回收試劑盒為Axygen公司產品。各種寡核苷酸序列由上海生物工程有限公司合成。

1.3 試驗方法

1.3.1 銀杏DNA提取 采用改良的CTAB法[8]大量提取銀杏基因組DNA。

1.3.2 基因組酶切與連接 用平末端限制酶EcoRⅤ、DraⅠ、SspⅠ、PvuⅡ、StuⅠ、HpaⅠ、ScaⅠ和SmaⅠ分別進行單酶切，37 ℃酶切過夜（8 h），各取5 μL用0.8%的瓊脂糖電泳檢測是否酶切完全，酶切產物分別純化回收；回收后與各自的接頭連接，體積為50 μL。連接反應體系為DNA酶切產物（模板）30 μL、T4 DNA Ligase Buffer （10×） 5 μL、接連體10 μL、T4 DNA Ligase 3 μL、ddH2O 2 μL，反應程序為16 ℃連接12 h。

1.3.3 引物設計及染色體步移擴增 根據Genebank提交的銀杏MECT基因cDNA序列（登錄號DQ102360）分別設計引物MT1、MT2（表1），與2個接頭引物AP1、AP2形成巢式引物，進行第一次步移擴增。將得到的目的片段連接到pMD18-T載體上，送出測序。根據第一次擴增的啟動子序列，繼續設計引物MT3、MT4（表1）進行了第二次步移并測序。

1.3.4 目的片段回收、片段與載體連接、轉化及測序 根據瓊脂糖電泳檢測擴增結果，采用膠回收試劑盒回收所需的目的片段。所用的T載體為pMD18-T Vector，之后與回收片段連接，并轉化大腸桿菌進行鑒定和篩選，將含有目的基因重組子的菌株送去測序。

1.3.5 生物信息學分析 用DNAMAN等生物學軟件對序列進行處理，然后將測序獲得的啟動子序列提交至PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）進行在線分析，預測啟動子序列保守區域中潛在的順式作用元件。通過McPromote在線工具預測其轉錄起始位點。

2 結果與分析

2.1 銀杏MECT基因啟動子序列克隆及驗證

將銀杏基因組用8個平末端限制性內切酶（EcoRⅤ、DraⅠ、SspⅠ、PvuⅡ、StuⅠ、HpaⅠ、ScaⅠ和SmaⅠ）分別進行消化，酶切產物加上接頭后作為模板與其特異性引物進行步移擴增，經2輪PCR后，電泳檢測結果如圖1所示，在ScaⅠ的酶切體系中得到了500 bp左右的PCR產物，將產物回收并測序。在第一次步移得到的上游啟動子序列（圖1A）的5′端設計兩個下游引物，繼續進行第二次步移擴增，圖1B即為第二次擴增結果。將2次步移的產物在Vector NTI軟件中進行序列拼接比對，得到了長982 bp的目的片段，通過分析比較證實該片段3′端序列與MECT基因cDNA序列的5′端部分片段重合一致，說明獲得的序列為銀杏MECT基因上游啟動子的部分片段。

2.2 銀杏MECT基因啟動子區域序列的生物信息學分析

銀杏MECT基因啟動子序列如圖2所示，通過McPromote預測其轉錄起始位點可能為位于982 bp處的堿基A，將此位點標記為+1。TATA-box位于上游-106 bp處，CAAT-box位于-150 bp處，該啟動子序列上含有多種對光照、干旱、傷害、金屬離子和細胞周期誘導響應的啟動子元件，也含有一些組織特異性啟動子元件，依據PLACE database （http：//www. dna.affrc.go.jp/PLACE/）分析結果已將部分作用元件在圖示中做了標記。

2.2.1 光調控元件 分析發現銀杏MECT啟動子序列含有多個與光調節相關的調控元件，如GATA-box （GATA）、GT-1（GRWAAW）等，GT-1存在于許多光調節基因中，是GT-1轉錄因子結合的保守位點；另有Inr element（YTCANTYY）、ASF1（TGACG）及I-box（GATAA）等均是與光響應有關的順式元件（表2）。

2.2.2 抗逆境脅迫及與激素響應相關的調控元件 從預測結果分析來看，有些啟動子元件既能響應逆境脅迫同時也與激素調節有關，說明逆境脅迫與激素調節存在一定的交叉作用，兩者互相關聯，體現了啟動子作用元件之間的互作性和復雜性。表3中有大量響應激素調節的順式元件，與細胞分裂素相關的ARR1（NGATT）8個，CPBCSPOR（TATTAG）3個，是依賴細胞分裂素的蛋白質結合位點；與脫落酸響應相關的元件有MYC（CANNTG）和MYB1AT（WAACCA）2種，其中MYC元件有6個；該序列中響應赤霉素的順式元件較多，其中WRKY（TGAC）是一種赤霉素信號途徑的轉錄抑制子，此類型的調節元件共6個，此外還有TATCCA序列、CAREs （CAACTC）、GARE（TAACAGA）和GA（TAACAAR）；另有2種與生長素作用相關的元件ASF-1 （TGACG）、CATATG序列；與乙烯作用相關的元件僅有1種ACS（TAAAATAT）。響應逆境脅迫的元件有：抗病蟲害響應元件TGTCA、抗損傷元件ERF3 （TGACY）、熱激響應元件HSE（CCAAT）及防衛基因的誘導元件W-box（CTGACY）。

2.2.3 其他類型調控元件 除對光、激素及逆境脅迫相關的元件外，銀杏MECT啟動子序列中還存在以下特異性元件：根組織特異性元件rolD（ATATT）、與苯丙氨酸和木質素代謝相關的元件MYBPLANT（MACCWAMC）、受糖抑制作用的元件SRE（TTATCC）、氧脅迫和銅離子響應元件CuRE（GTAC）、淀粉酶響應元件amylase-box（TATCCAT） 等，詳見表4。

3 小結與討論

本試驗通過設計特異性引物，采用染色體步移的方法克隆了MECT基因翻譯起始位點上游982 bp的啟動子序列，對其調控區域進行了生物信息學分析。分析結果表明，銀杏MECT基因啟動子中含有光響應元件GATA-box（GATA）、GT-1（GRWAAW）及I-box（GATAA）等，其中GATA-box（GATA）是捕光葉綠素a/b蛋白復合體基因（cab）中大量存在的光應答元件，cab即是典型的光依賴型基因。通常GATA-box（GATA）作為一種光開關（Light switches）存在于植物基因啟動子中。GT-1 （GRWAAW）存在于某些光誘導啟動子中，但也可在不顯示光效應的啟動子中存在，并且在某些光誘導啟動子中，GT-1 缺失也不會完全喪失光調節特性。因此，GT-1在光調節表達中可能不是必需的。I-box是光調節所必需的調控元件，若缺失或突變都會導致啟動子光誘導能力下降，在水稻Osrbcs[9]、番茄PSY[10]、豌豆rbcS[11]等基因啟動子中都存在。

在銀杏MECT基因啟動子中還含有各種激素響應元件，與細胞分裂素相關的ARR1（NGATT）元件在作用過程中能與轉錄因子ARR1結合，是植物對細胞分裂素的應答調節因子[12]。脫落酸響應相關的元件MYC（CANNTG）、MYB1AT（WAACCA）也與逆境脅迫誘導相關，推測當植物處于脫水、干旱等逆境脅迫條件時，MYB、MYC可作為轉錄因子結合位點，以某種方式促進脫落酸等植物內源激素合成，通過落葉、促進休眠等方式減少養分和水分消耗，以起到抗脅迫作用，維持植物正常生命活動。由此發現，許多響應逆境脅迫的元件同時也是某些激素的響應元件，如ASF-1（TGACG）既是生長素的應答元件同時也是一種抗病害的響應元件。該啟動子中還含有熱激響應元件HSE（CCAAT），這類熱誘導啟動子對刺激產生響應的延遲時間短、活性強，一般能快速對高溫脅迫作出反應[13]。

由序列分析的預測結果可知，在銀杏MECT基因啟動子序列中含有許多重要的順式作用元件。通過分析各種類型元件的作用特點，可以了解影響其作用的因素，從而對萜內酯合成的影響因素做出初步判定，為后面啟動子的功能分析提供有效信息。

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