酵母菌制劑保存的穩定性研究

摘要：選取3種不同濃度的酵母菌制劑（1.67×10-2、5.00×10-2、8.00×10-2 g/mL）分為試驗組1、2和3，在4 ℃下保存360 d，每30 d取樣1次，采用稀釋平板法進行活酵母菌計數，檢測酵母菌制劑保存的穩定性。結果表明，隨著保存時間延長，試驗組1、3的活酵母菌數呈下降趨勢，試驗組2的活酵母菌數呈先下降后升高的趨勢。在第30、90、180和360 天時，試驗組1酵母菌存活率分別為76.27%、28.64%、20.85%和11.10%，試驗組2酵母菌存活率分別為106.25%、13.63%、121.25%和101.88%，試驗組3酵母菌存活率分別為126.37%、90.11%、69.78%和56.04%。可見，酵母菌制劑試驗組3保存的穩定性良好，4 ℃條件下保存期可達到180 d以上。

關鍵詞：酵母菌；制劑；保存；穩定性

中圖分類號：S859.1；Q93-336 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）07-1661-03

在抗生素限制使用的時代，微生態制劑作為較理想的替代品被廣泛應用。微生態制劑又稱為微生態調節劑，是指可以提高人類、畜禽宿主或植物寄主等健康水平和促進生長的菌群及其代謝產物的制品[1]，具有無毒副作用、無殘留和無耐藥性等特性。目前，用于微生態制劑的微生物主要有芽孢桿菌屬、乳桿菌屬和酵母菌屬等[2]。其中，酵母菌屬于兼性厭氧型真菌，可以耐受一定劑量的抗生素，而大多微生態制劑是細菌制劑，對抗生素敏感，所以酵母菌能在含有抗生素的機體或環境中應用，并逐漸取代抗生素。此外，酵母菌菌體含有豐富的蛋白質、氨基酸、維生素等成分，還可以分泌酶類、糖類、脂類和生長因子等[3]。酵母菌是繼動物蛋白質和植物蛋白質之后的一種重要蛋白質來源，又有“菌體蛋白質”之稱[4]。研究表明，每100 kg干酵母所含的蛋白質，相當于500 kg大米、217 kg大豆或250 kg豬肉所含蛋白質的含量[5]。

酵母菌有著悠久的應用史，尤其在面包制作和釀酒行業。近幾年，酵母菌以微生態制劑的形式廣泛應用于食品、保健品、藥品、飼料等行業。酵母菌制劑主要作為多功能食品、保健品、添加劑和醫藥品，甚至用作含重金屬廢水的凈化劑等[6，7]。微生態制劑中起重要作用的是活性微生物，保證制劑中活性微生物的含量對其發揮益生作用至關重要。

酵母菌制劑保存的穩定性是指該制劑從制備到使用期間活酵母菌數的變化速度和程度，是評價制劑質量的重要指標之一。穩定性研究是制劑質量控制研究的主要內容之一，與制劑質量研究和質量標準的建立緊密相關。本研究通過對酵母菌制劑在一定條件下活菌數隨時間變化規律進行研究，掌握制劑保存的穩定性變化，為制劑的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 酵母菌液由中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所提供。

1.1.2 試劑與培養基 瓊脂粉購自生工生物工程（上海）股份有限公司；麥芽汁購自蘭州啤酒廠；固體麥芽汁：瓊脂粉+麥芽汁。

1.1.3 儀器 電子天平（武漢格萊莫檢測設備有限公司），PHSJ-4F型實驗室pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司），LDZX-30KB型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠），BS-2F型數顯振蕩培養箱（金壇市華城開元實驗儀器廠），恒溫培養箱（上海申賢恒溫設備廠）。

1.2 方法

取1 mL濃度為1.0×107 CFU/mL的酵母菌液加入99 mL麥芽汁培養基，培養72 h后4 ℃保存，作為供試菌液。將供試菌液從4 ℃取出后室溫放置1 h，置于搖床1 h（速度110 r/min），以使菌液均勻。取100 μL菌液加入到9 900 μL無菌生理鹽水中，菌液濃度稀釋10-1，振蕩1 min，依次稀釋10-2、10-3、10-4、10-5和10-6，選取3種不同濃度供試菌液（1.67×10-2、5.00×10-2、8.00×10-2 g/mL）作為試驗處理，分別為試驗組1、2和3，涂布于固體麥芽汁培養基，置于28 ℃恒溫箱培養48～72 h（做3次平行，取其平均值）。試驗組1、2和3添加某種物質，對照組不添加該種物質。將3種不同濃度酵母菌制劑及其同期對照組于冰箱4 ℃保存，試驗期為360 d，每30 d取樣1次，采用稀釋平板計數法進行活酵母菌計數，以平均活酵母菌數表示制劑保存的穩定性。

2 結果與分析

對不同濃度酵母菌制劑及其同期對照組進行0～360 d保存穩定性的檢測，測定結果如圖1所示。由圖1可知，隨著保存時間的延長，試驗組1、3的活酵母菌數呈下降趨勢，試驗組2的活酵母菌數呈先下降后升高的趨勢；在相同時間內，除試驗組2保存90 d外，所有試驗組的酵母菌存活率均高于對照組；與保存90～360 d相比，在0～90 d內試驗組1、3和對照組的活酵母菌數存活率均偏高。在第30、90、180和360天時，試驗組1酵母菌存活率分別為76.27%、28.64%、20.85%和11.10%，試驗組2酵母菌存活率分別為106.25%、13.63%、121.25%和101.88%，試驗組3酵母菌存活率分別為126.37%、90.11%、69.78%和56.04%。試驗組1酵母菌存活率均低于試驗組2和3；試驗組2酵母菌存活率大部分測定時間高于100%。說明酵母菌制劑試驗組3保存的穩定性良好。

3 小結與討論

目前，微生態制劑保存的穩定性是確保制劑使用效果的基礎。張世風等[8]報道溫度對菌種保存期存活率影響最大，微生物添加劑保存溫度一般為2～8 ℃。鐘青萍等[9]報道納豆菌微生態制劑在4 ℃冷藏保存，有較好的穩定性。因此，本試驗選取4 ℃冷藏保存酵母菌制劑。

近年來，大多微生態制劑通過膠囊化、添加保護劑和凍干等形式，提高制劑保存穩定性。宋文龍等[10]采用乳化和擠壓法包埋枯草芽孢桿菌活菌制劑；徐暉等[11]研究微膠囊化枯草芽孢桿菌制劑，均在4 ℃冷藏下保存，提高了制劑保存的穩定性。彭虹旎等[12]報道添加保護劑的屎腸球菌凍干樣品，在4 ℃存放4周后，存活率高于97.90%。蔡凱凱[13]將納豆芽孢桿菌制劑制成凍干產品4 ℃存放1個月，菌制存活率為91.4%；固態發酵產品4 ℃存放1個月，菌制存活率為49.1%。本試驗制備不同濃度酵母菌制劑，于4 ℃冷藏保存，測定酵母菌制劑的保存穩定性。

本試驗結果表明濃度不同，酵母菌制劑的酵母菌存活率不同。在不同時期，試驗組1酵母菌存活率均低于試驗組2和3；試驗組2酵母菌存活率大部分時間高于100%；試驗組3酵母菌存活率逐漸下降，但180 d時酵母菌存活率為69.78%，360 d時還高于50%。相關研究表明，在低于0 ℃或高于47 ℃時，酵母菌一般不會增殖。試驗組2酵母菌存活率大部分時間高于100%，可能是酵母菌在4 ℃保存時增殖引起的，有待于進一步研究。本試驗各試驗組酵母菌存活率的結果與沈麗琳等[14]報道基本一致，并且優于史懷平[15]的報道結果。此外，在不同時期，除試驗組2保存90 d外，本試驗中所有試驗組的酵母菌存活率均高于對照組。本試驗結果表明，酵母菌制劑試驗組3保存的穩定性良好，4 ℃條件下保存期為180 d時，酵母菌存活率較高。選擇適宜的濃度可以提高酵母菌制劑保存的穩定性，其作用機理有待進一步研究。

參考文獻：

[1] 康 白.微生態學原理[M].遼寧大連：大連出版社，1996.2.

[2] SEKHON B S，JAIRATH S. Prebiotics， probiotics and synbiotics： An overview[J]. Journal Pharmaceutical Education Research，2010，1（2）：13-36.

[3] PANDEY A. Concise Encyclopedia of Bioresource Technology[M].New York：Food Products Press，2004.

[4] 王 卓，顧正彪，洪 雁.馬鈴薯渣的開發與利用[J].中國糧油學報，2007，22（2）：133-136.

[5] 孫萬儒.酵母菌[J].生物學通報，2007，42（11）：5-10.

[6] BEKATOROU A， PSARIANOS C， KOUTINAS A A. Production of food grade yeasts[J]. Food Technology and Biotechnology， 2006， 44（3）： 407-415.

[7] FERREIRA I， PINHO O，VIEIRA E， et al. Brewer's Saccharomyces yeast biomass：Characteristics and potential applications[J]. Trends in Food Science Technology， 2010， 21（2）：77-84.

[8] 張世風，翟建新.影響飼用微生物添加劑作用效果的原因淺析[J].河南畜牧獸醫，1999，20（3）：22-23.

[9] 鐘青萍，王發祥，鐘士清，等.納豆菌微生態制劑的穩定性研究[J].食品科學，2006，27（3）：133-136.

[10] 宋文龍，叢麗娜，王紅英.枯草芽孢桿菌發酵條件的優化及微生態制劑的研制[J].食品工業科技，2013，34（17）：206-209.

[11] 徐 暉，魏培蓮.枯草芽孢桿菌微生態制劑的研制[J].氨基酸和生物資源，2008，30（2）：56-58.

[12] 彭虹旎，梁 莉，陳西廣.屎腸球菌冷凍干燥保護劑篩選及穩定性比較研究[J].食品科學，2013，34（3）：239-242.

[13] 蔡凱凱.以米糠為基質納豆芽孢桿菌微生態制劑的研究[D]. 南昌：江西農業大學，2013.

[14] 沈麗琳，夏啟明，胡俊敏，等.乳酸桿菌栓劑的研制及其質量控制[J].天津藥學，2004，16（2）：35-36.

[15] 史懷平.朱鸚消化道正常菌群的分離鑒定及微生態制劑的研究 [D].陜西楊凌：西北農林科技大學，2005.