李子蜂花粉中黃酮苷及酚胺類化合物鑒定

張勇 王莉 喬江濤

（1江蘇蜂奧生物科技有限公司，泰州225312；2江蘇鴻祺生物科技有限公司，泰州225312；3中國農業科學院蜜蜂研究所，北京100093）

花粉是顯花植物花藥產生的雄性生殖細胞，通常由蜜蜂、蝴蝶、飛蛾、蜂鳥等傳粉者傳遞到雌花的柱頭上[1]。蜜蜂是水果、蔬菜、花卉和農作物最重要的傳粉者，世界上超過三分之一的農作物生產依賴于蜜蜂授粉[2]。花粉提供了蜂群生長發育所需的營養，還有助于蜜蜂降低對殺蟲劑的敏感性，增強蜜蜂的免疫功能，并幫助蜜蜂對抗病原體，如微孢子蟲、細菌和病毒[3]。

由于蜂花粉營養價值和生物活性，它已經在人類的飲食中使用許多世紀。近年來，蜂花粉作為人類膳食補充劑被廣泛應用于食品加工中[3]。建議每天攝入花粉，因為它對人體健康有益，如有助于減緩衰老過程，降低膽固醇水平，調節腸道功能，對心血管系統、皮膚和視力有好處，而且具有抗生素、抗癌和抗氧化生物活性。花粉在醫學上最重要的用途是它對前列腺疾病的預防和治療作用[4]。蜂花粉作為前列腺疾病的主流藥物，從1988年開始在中國市場廣泛使用。蜂花粉的這些功能特性主要是由于其含有多種生物活性化合物，如蛋白質、碳水化合物、粗纖維、氨基酸、維生素、礦物質和脂肪酸，以及植物次生代謝產物。植物化學物質作為植物的代謝物，廣泛存在于蜂花粉中[1]。以往的研究主要集中在花粉中的酚酸和黃酮類化合物，尤其是對香豆酸、山奈酚、槲皮素和異鼠李素等具有廣泛的生物活性，如抗腫瘤、抗衰老、抗炎、抗糖尿病、抗癌和抗氧化等[5]。近年來，蜂花粉中的另一種生物活性物質多胺逐漸引起人們的關注。多胺通常在花粉中與羥基肉桂酸結合。這些成分通常被命名為羥基肉桂酸酰胺（HCAA）衍生物或酚酰胺。蜂花粉中的酚酰胺具有結構多樣性的特點，其主要成分是酚類物質（對香豆酸、阿魏酸和咖啡酸）與脂肪族或芳香族胺結合，如腐胺、精胺和亞精胺[6]。然而，不同植物的花粉代謝途徑不同，造成酚酰胺的種類不同的單花蜂花粉中表現出很大的差異。

本文采用高效液相色譜四極桿飛行時間串聯質譜法（high-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight-mass spectrometry,HPLC-QTOF- MS），對李子蜂花粉中的黃酮苷和酚胺類化合物進行結構鑒定為蜂花粉的生物活性及藥理學作用研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

分析級甲醇、無水乙醇、甲酸購自北京索萊寶科技有限公司；色譜級甲醇、乙酸，質譜級乙酸購自美國Fisher公司；實驗用水為超純水。

1.2 實驗材料

李子蜂花粉樣品于2020年采自廣西，樣品采集后存放于4℃冰箱備用。

1.3 實驗儀器設備

離心機（美國Thermo Fisher公司）；無菌注射器（江蘇正康醫療器械有限公司）；0.22μm 微孔濾膜（Milipore 公司）；移液器（美國Thermo Fisher公司）；數控超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）；LC-6AD高效液相色譜儀（日本島津公司）；高效液相色譜儀和6520 四級桿-飛行時間質譜（美國Agilent 公司）；JECHERS自動樣品制備系統（上海凈信實業發展有限公司）；

1.4 方法

1.4.1 蜂花粉樣品前處理

準確稱取3g蜂花粉置于50ml離心管中， 75%乙醇溶解并定容至30ml。自動樣品制備系統條件：頻率120Hz，運行時間60s。蜂花粉懸濁液配平后在6000r/min條件下離心5min，取上清過0.22μm微孔濾膜過濾后，用于HPLC分析。

1.4.2 高效液相色譜分析條件

色譜柱：Phenomenex Gemini C18(150 mm×4.6 mm, 5μm)；流速：0.65 ml/min；流動相A：0.2%乙酸水流動相B：2%乙酸甲醇，進樣量為10μl、檢測波長270nm；柱溫箱溫度為38℃。

梯度洗脫程序為：0～10min，10%～22% B；10～16min，22%～28%B；16～30min，28%～31%B；30～47min，31%～34%B；47～75min，34%～43%B；75～108min，43%～45%B；108～110min，45%～51%B；110～145min，51%～59%B；145～150min，59%～80%B。

1.4.3 樣品質譜分析條件

液相質譜（LC-QTOF）分析條件：離子源為ESI源（電噴霧），離子源噴射電壓為4kV，出口電壓為130V、加熱的溫度350℃、氮氣（N2）流速為11L/min、碰撞氣體為氦氣、霧化氣流速為80kPa、霧化器的壓力40psi、質量掃描范圍m/z =100～900Da。

2 結果與分析

2.1 蜂花粉高效液相色譜圖

李子蜂花粉提取物經HPLC分離結果如圖2所示，從圖中，可以清楚的看到油菜蜂花粉中所含物質豐富，出峰時間緊湊，分別 在25min、40min和105min 成簇出現，對圖1所示所有峰進行出峰時間和紫外光譜對比。根據文獻查閱對比、HPLC-MS鑒定數據對比及標品驗證，對圖1標注結果化合物1和化合物2進行鑒定，結果如表1。

圖1 李子蜂花粉

表1 正離子模式下李子蜂花粉中化合物信息

2.1.1 化合物 1結構解析

圖3及表1為化合物正離子模式下二級質譜圖，可知化合物1的準分子離子峰[M+H]+m/z 641.3537，化合物1的分子量為640Da。通過比對圖2二級質譜數據斷裂碎片，進一步推測化合物裂解途徑論證該化合物結構，其表現為顯著的多酚類化合物的電離特征。準分子離子峰[M+H]+（m/z）在斷裂1個葡糖苷（C6H5O10）碎片后，產生分子離子碎片峰[M+H]+m/z 479.1346，而后在第二次相繼斷裂1個葡糖苷（C6H5O10）碎片，得到分子離子碎片峰 [M+H]+m/z 317.0770，最終得到相對分子質量317Da即為異鼠李素相對分子質量。結合紫外光譜，化合物1在328nm、354nm處有最大吸收峰，符合多酚類紫外吸收特征。化合物我們最終鑒定為異鼠李素-3-O-龍膽二糖糖苷。

圖2 李子蜂花粉HPLC 譜圖

圖3 正離子模式下化合物1的質譜圖（LC-QTOF-MS/MS）

2.1.2 化合物2結構解析

圖4及表1為化合物正離子模式下二級質譜圖，可知化合物2的準分子離子峰[M+H]+m/z 611.1531，因此化合物2的分子量為610 Da。通過比對圖4二級質譜數據斷裂碎片，進一步推測化合物裂解途徑論證該化合物結構。其表現為顯著的多酚類化合物的電離特征。準分子離子峰[M+H]+(m/z)在斷裂1個葡糖苷（C6H5O10）碎片后，產生分子離子碎片峰[M+H]+m/z 449.1024，而后在第二次相繼斷裂1個葡糖苷（C6H5O10）碎片，得到分子離子碎片峰 [M+H]+m/z 287.0510，最終得到相對分子質量288Da即為山奈酚相對分子質量。結合紫外光譜，化合物2在348nm處有最大吸收峰，符合多酚類紫外吸收特征。化合物我們最終鑒定為山奈酚-3-O-槐糖苷。

圖4 正離子模式下化合物2的質譜圖（LC-QTOF-MS/MS）

2.1.3 化合物3、4、5、6結構解析

從表1中可知，化合物 3、4、5和6相對分子質量相同，均為583，四個峰二級質譜斷裂相同，表明四個化合物為異構體。由圖5可知道，準分子離子峰584m/z[M+H]+在斷裂一個香豆酰碎片（-146）后，產生碎片離子438m/z[M+H]+，而后繼續斷裂一個香豆酰碎片（-146）產生碎片離子292m/z[M+H]+。此外，四個化合物的保留時間之間增長，最大紫外吸收逐漸增大，表明四個化合物可能是順反異構體。由于反式香豆酰屬于平面型結構，雙鍵與處于同一平面的苯環容易形成Π-Π共軛。對于順式香豆酰，由于空間位阻，造成雙鍵與苯環處于非平面，不易發生共軛，而順式與反式的紫外最大吸收波長略有不同，與順式相比，反式的最大吸收波長位于長波端。另外，順式異構體是兩個電負性相同的原子或原子團處在分子的同側，造成偶極矩的疊加，增加不對稱性，不像反式那樣比較對稱地排列，因而順式分子的偶極距比反式大，為偶極分子，有較弱的極性。

圖5 正離子模式下化合物6的質譜圖（LC-QTOF-MS/MS）

圖6 化合物6的質譜斷裂圖

最后化合物峰3、4、5、6分別被鑒定為順, 順, 順-三-對-香豆酰亞精胺、順,順, 反-三-對-香豆酰亞精胺、反, 順, 反-三-對-香豆酰亞精胺和反, 反, 反-三-對-香豆酰亞精胺。化合物6的質譜斷裂規律。

3 討論與結論

本研究采用HPLC-QTOF-MS法，從李子蜂花粉中鑒定出2個黃酮苷類化合物，分別是異鼠李素-3-O-龍膽二糖苷和山奈酚-3-O-槐糖苷。此外首次從李子蜂花粉中鑒定出4個酚胺類成分，分別是 順, 順, 順-三-對-香豆酰亞精胺、順, 順, 反-三-對-香豆酰亞精胺、 反, 順, 反-三-對-香豆酰亞精胺和反,反, 反-三-對-香豆酰亞精胺。本研究對李子蜂花粉的功能活性研究提供理論參考。