煙草鐘器腐霉的分子鑒定與致病力測定

邊傳紅 王偉杰 趙世民 康業斌

摘 ?要：從河南省嵩縣送檢的煙草莖黑腐病樣本上分離獲得1株腐霉菌，為明確該菌的種類及對煙草的致病力，對所得菌株進行形態學鑒定、DNA序列分析和致病性測定。結果表明，菌株菌落呈放射狀型，并逐漸變為花瓣型，菌絲無隔;孢子囊球形、梨形;藏卵器球形;雄器鐘狀或不規則;rDNA-ITS序列測定分析，該菌序列與GenBank上登錄號KC014615.1和GU133597.1等的序列同源性大于99%，鑒定為鐘器腐霉（Pythium vexans de Bary）。對培育到10葉期的‘中煙100品種接種，7天后該菌的病情指數為48，對照瓜果腐霉（P. aphanidermatum）的病情指數為62.7，表明其對‘中煙100的致病力不及瓜果腐霉。

關鍵詞：煙草;鐘器腐霉;rDNA-ITS;致病性測定

中圖分類號：S432.4 ? ?文獻標志碼：A ? ?論文編號：2014-0479

Molecular Identification and Pathogenicity of Pythium vexans Isolated from Tobacco

Bian Chuanhong1， Wang Weijie2， Zhao Shimin3， Kang Yebin1

（1College of Forestry， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471003， Henan， China;

2Songxian Branch Company of Luoyang Tobacco Company， Songxian 471400， Henan， China;

3Luoyang Tobacco Company of Henan Tobacco Company， Luoyang 471023， Henan， China）

Abstract： Pythium was isolated from tobacco stems back rot samples in Song County of Henan Province. In order to know its classification and pathogenicity to tobacco， the morphologic characters that based on microscopy technology were examined and recorded， the rDNA-ITS sequences were analyzed， the pathogenicity tests were conducted. The results showed that the colonies were actinomorphic and gradually grow into petaliform; hyphas were without separate; sporangiums were spherical or pear-shaped; archegoniums were spherical; antheridiums are bell-shaped or irregular. According to the results of the analysis of rDNA-ITS sequences， the sequence homology was more than 99% when it was compared with the sequence of registration number kc014615.1 and gu133597 in GenBank. Therefore， the pathogen was identified as Pythium vexans de Bary. Seedings in ten leaf stage of ‘Zhongyan 100 tobacco variety were inoculated with P. vexans de Bary， and the disease symptoms and the disease indexes were surveyed and recorded in the 7th day， the disease index of Pythium vexans was 48 and the P. aphanidermatum was 62.7， the results indicated that the pathogenity of Pythium vexans was less than P. aphanidermatum.

Key words： Tobacco; Pythium vexans; rDNA-ITS; Pathogenicity

0 ?引言

腐霉（Pythium）是一種土壤習居菌，引起煙草苗期猝倒病或成株期莖黑腐病，在國內各產煙區均有分布[1]。國內目前報道侵染煙草的腐霉有瓜果腐霉（P. aphanidermatum）、德巴利腐霉（P. Debaryanum）、終極腐霉（P. ultimum）、畸雄腐霉（P. irregulare）[2]、異絲腐霉（P. diclinum）[3]共5種。2011年7月，河南省嵩縣煙草公司送檢的‘中煙100煙草病株，在莖的近土面處產生褐色水漬傷痕，主根與支根出現褐色病斑，嚴重者呈水漬狀腐爛，病樣采用組織分離法獲得純菌株，其分子鑒定及對煙草致病力的研究結果報道如下。

1 ?材料與方法

1.1 ?病原菌的分離

用清水將發病煙株根莖部沖洗干凈，吸水紙吸干組織表面水分，在超凈工作臺上用解剖刀將莖部病斑表層皮削去，再切取病、健交界處組織，置于盛有無菌水的滅菌培養皿中，剪成約5 mm×5 mm大小的組織塊，并用無菌水清洗3次，置于滅菌的濾紙上吸干水分后轉接于加乳酸的PDA（1000：1）平板上，25℃黑暗條件下培養，待長出菌落后，挑取邊緣菌絲接種于PDA平板上進行純化，獲得純菌株。

1.2 ?形態學鑒定

參考Plaats-Niterink[4]和余永年[5]的方法，菌株在PDA培養基上養3～5天后，用直徑5 mm的打孔器打取菌餅，轉接于CMA、OA培養基上，25℃黑暗條件下培養，7天后觀察菌落特征，在顯微鏡下觀察并測量子實體大小。用十字交叉法測菌落直徑，計算日生長速度[6]。

1.3 ?分子生物學鑒定

采用CTAB法[7]提取腐霉菌的基因組DNA，利用通用引物ITS1和ITS4對其核糖體DNA-ITS序列進行PCR擴增。反應體系[8]：10×PCR Buffer ? ? ? ?2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，10 μmol/L的引物 ? 1 μL，模板DNA 1 μL，5 U/μL Taq聚合酶 0.25 μL，用ddH2O將反應體系補至25 μL。PCR反應程序[12]：94℃預變性 5 min，94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸2 min，35個循環，最后72℃延伸10 min，4℃保存。擴增產物在1.0%的瓊脂糖凝膠中電泳，經EB染色，紫外燈下檢測擴增產物的有效性。檢測到合適的條帶后，將其所對應的原始擴增產物（未純化）40 μL寄往上海生工測序。

1.4 ?致病力測定

1.4.1 ?煙苗培育方法 ?將營養土（江西天慧牌煙草專用育苗基質與土壤等量混合）裝入育苗托盤中鋪平，將篩選好的‘中煙100種子播下，每格1～3粒，再覆蓋1層營養土，噴水至足夠濕潤但無積水，待子葉展開后減少噴水量，在煙苗長至十字期，將其移栽到10 cm×10 cm的營養缽中，室內每天12 h光照培育至10葉期備用[9-10]。

1.4.2 ?接種方法 ?腐霉菌在PDA培養基上培養3～4天后，用打孔器（直徑7 mm）在菌落邊緣打取菌碟，選取健康的長勢一致的煙株，用解剖針在其莖基處刺8～10傷口，把菌碟貼在傷口處，并用濕脫脂棉球保濕固定，每個處理設15個重復[11-12]。以瓜果腐霉（P. aphanidermatum）菌株作對照。

1.4.3 ?觀察記載 ?‘中煙100接種腐霉后24 h黑暗處理，24 h后室內12/12光照培育，3～7天內定期觀察病害發生情況，根據植株莖部和葉片癥狀分級[13-14]，分級標準參照Shehata[15]的報道，略作修改。0級—不發病;1級—病斑小于植株莖圍1/2，葉片不萎蔫;2級—病斑小于植株莖圍1/2，僅接種部位附近1～2個葉片萎蔫;3級—病斑大于植株莖圍1/2，萎蔫葉片數小于總葉片數的1/2;4級—病斑大于植株莖圍1/2，萎蔫葉片數大于總葉片數的1/2，但頂部1～2片不萎蔫;5級—病斑環繞植株莖圍，全株萎蔫。

病情指數（DI）計算如式（1）[8-11]：式中：DI為病情指數;Si為病級;ni為相應病株數;i=1、2、3···;N為調查總株數。

DI=Σ（Sini）/5N×100…（1）

2 ?結果與分析

2.1 ?培養性狀與形態特征

菌株在CMA、OA培養基上菌落呈圓型、白色、放射狀，并逐漸變為花瓣型，邊緣整齊，氣生菌絲稀薄（圖1），在CMA培養基上日生長速率為22 mm/d。在光學顯微鏡下觀察菌絲直徑約2.5～6.5 ?m，平均直徑約 ?4.1 ?m，菌絲無隔，非常發達且分枝繁茂;孢子囊頂生，多球形，少數梨形、袋形、卵圓形，直徑約12.5～ ? ? ? ?20.0 μm，平均直徑約16.1 ?m;藏卵器為球形，平滑，頂生，有時間生，直徑約12.5～30.0 μm，平均約18.0 μm;雄器的形狀有鐘狀、拳頭狀、粒狀或不規則形，頂生，每一藏卵器有1～2個雄器;卵孢子球形，光滑，大多不滿器，少數滿器，大小約13.8～25 μm，平均約18 μm，壁厚約0.6～2.5 μm，平均約1.4 μm。根據以上形態學特征，將其鑒定為腐霉屬（Pythium sp.）。

2.2 ?核糖體DNA-ITS序列分析

對菌株進行rDNA-ITS序列測定，獲得有效序列長度609 bp，在GenBank上進行BLAST比對，使用Clustal_X （1.83）軟件對自測序列以及從GenBank下載的相關序列進行較準后，以距離法（neighbor-joining 法）[16]利用MEGA6軟件[17]構建系統發育樹（圖2）。結果表明，該序列與登錄號為KC014615.1和GU133597.1 等的Pythium vexans（鐘器腐霉）親緣關系最近，rDNA-ITS序列同源性大于99%。

2.3 ?致病性測定

接種鐘器腐霉菌1～2天后，接種點病斑不明顯，近接種點1～2片葉萎蔫;3～4天后1株煙萎蔫，其余煙株病斑無擴展，但下部3～4片葉萎蔫;接種5～6天后病情無擴展;其中1株1～2天后接種點病斑水漬狀，向上快速蔓延至生長點，大部分葉片萎垂。病情指數48。對照瓜果腐霉接種1～2天后，接種點病斑不明顯，近接種點1～2片葉萎垂;3～4天后有3株煙苗萎蔫，其余煙株近接種點1～3片葉枯萎，病斑無明顯蔓延;接種5～6天后3株煙枯死，5株煙病斑繞莖1周但無明顯蔓延，大部分葉片萎垂，其余煙株病斑無擴展;其中1株接種1～2天后接種點病斑水漬狀并快速蔓延至生長點，葉片萎蔫，煙株枯死。病情指數為62.7（圖3）。

3 ?結論

采用常規組織分離法獲得的菌株在CMA、OA上培養，菌落呈放射型，并逐漸變為花瓣型;菌絲無隔膜;孢子囊多球形，頂生或間生;雄器鐘狀或不規則，頂生;藏卵器球形，平滑，多頂生;卵孢子球形，大多不滿器。以上形態學特征與腐霉屬（Pythium sp.）的特征相似。

采用CTAB法提取菌株的基因組DNA，利用通用引物ITS1和ITS4對所提取的DNA進行PCR擴增，rDNA-ITS序列測定，獲得有效序列長度609 bp，在GenBank上進行BLAST比對，并利用MEGA6軟件以距離法構建系統發育樹，從發育樹可得出菌株與鐘器腐霉（Pythium vexans de Bary）親緣關系最近，rDNA-ITS序列同源性大于99%。根據菌株的形態特征及其rDNA-ITS序列測定比對結果，參考國內外文獻資料，將其鑒定為鐘器腐霉（Pythium vexans de Bary）。

采用缽栽‘中煙100的10葉期煙苗針刺接種進行致病力測定的結果表明，鐘器腐霉的病情指數為48，瓜果腐霉侵染的病情指數為62.7，鐘器腐霉的致病力弱于瓜果腐霉。

4 ?討論

目前，世界已報到腐霉屬有200多種，具有致病性的有80多種[18]。HO Hon-Hing[19]報道中國腐霉屬有64個種，其中大多數腐霉種對植物具有致病性，寄生植物的有44個種。王家和[2]1994—1995年分別從云南省11個主要產煙區，采集根莖病害標樣226份，土壤標樣60份，分離純化到42個菌株，經致病性測定，侵染煙草的腐霉有瓜果腐霉（P. aphanidermatum）、德巴利腐霉（P. Debaryanum）、終極腐霉（P. ultimum）、畸雄腐霉（P. irregulare），其中P. aphanidermatum對煙草致病力最強，但對病原菌種類的鑒定僅依據形態學特征，缺乏分子生物學鑒定的支持。法國腐霉學者Paul在20年間利用形態特征和rDNA-ITS序列分析發現10多個腐霉新種[8]。本試驗利用形態學及rDNA-ITS序列分析相結合的方法鑒定病原菌，結果更真實可靠。

文獻報道鐘器腐霉對各種蔬菜、果木、茶葉、甘蔗、薯類、麥類等50種以上經濟植物都有致病性[20]，王寬倉[21]研究了鐘器腐霉、終極腐霉、瓜果腐霉、鏈狀腐霉等7種腐霉對13種主要蔬菜和瓜類的致病性，結果表明終極腐霉、瓜果腐霉致病性最強，其次為鏈狀腐霉，而鐘器腐霉及其他腐霉對蔬菜的致病力較弱。Mulder[14]研究了與瓜果腐霉、間型腐霉、終極腐霉等幾種腐霉對蘋果幼苗的致病力，結果表明鐘器腐霉對蘋果幼苗的致病力弱，瓜果腐霉對蘋果幼苗的致病力無致病力。筆者在室內人工條件下測定了鐘器腐霉菌對河南省普遍種植的‘中煙100煙草品種苗期的致病力，結果表明鐘器腐霉的致病力弱于瓜果腐霉，至于該菌對其他煙草品種苗期的致病力以及煙草成株期的致病力有待進一步研究。

Shehata[15]在對煙草猝倒病病情調查時采用了5級分級標準，筆者在此基礎上，結合中華人民共和國煙草行業標準——煙草病害分級及調查方法[22]，制訂了苗期由腐霉菌侵染煙草引起的煙草猝倒病的6級分級標準，可為該病害苗期病情調查及苗期接種試驗作參考。

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