外源NO對低溫脅迫下豇豆幼苗生長和生理特性的影響

郭經緯　商桑　穆大偉　田麗波

摘 要 研究不同濃度的外源NO供體硝普鈉（sodium nitroprusside， SNP）溶液對8 ℃低溫脅迫下豇豆幼苗生長和生理特性的影響，結果表明，0.5～1.5 mmol/L外源NO處理下，豇豆幼苗葉面積、根冠比、壯苗指數有所提高，脯氨酸（Pro）、可溶性蛋白和葉綠素含量增加，丙二醛（MDA）含量降低。過高或過低濃度的外源NO對低溫脅迫下豇豆幼苗生長的緩解作用均不顯著，過低濃度的外源NO會促進MDA累積。在低溫脅迫下，適當濃度的外源NO能促進脯氨酸和可溶性蛋白的形成，提高葉綠素含量，降低膜脂過氧化程度，從而增強豇豆幼苗對低溫脅迫的適應性。

關鍵詞 外源NO；低溫脅迫；豇豆；生長指標；生理特性

中圖分類號 S643 文獻標識碼 A

Effects of Exogenous Nitric Oxide on Growth and Physiological

Characteristics of Asparagus Bean Deedlings Under Cold Stress

GUO Jingwei， SHANG Sang*， MU Dawei， TIAN Libo*

Key Laboratory of Protection and Developmental Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources /

College of Horticulture and Landscape Architecture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract The effects of exogenous NO donor sodium nitroprusside（SNP）solution with different concentrations on the growth and physiology characteristics of Asparagus bean seedlings which were treated at 8 ℃ low temperature stress were studied. The results showed that the leaf area， root/shoot ratio and strong seedling index increased； the content of proline， soluble protein and chlorophyll increased and the content of MDA decreased for the 0.5～1.5 mmol/L exogenous NO treatment. The alleviating effects of exogenous NO with too high or too low concentration on the growth were not significant and the content of MDA increased when the exogenous NO concentration was too low. The exogenous NO with proper concentration could promote the formation of proline， soluble protein， improve the content of chlorophyll and decrease membrane lipid peroxidation to enhance the adaptability for low temperature stress.

Key words Exogenous NO； Low temperature stress； Asparagus bean； Physiological index； Morphological index

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.12.012

一氧化氮（nitric oxide，NO）作為植物生長發育過程中重要的活性分子，可以提高植物對非生物脅迫的抗性，并且參與多種生理過程[1-2]。已有研究結果表明，外源NO供體硝普鈉（SNP）是植物新的生長調節劑，在緩解植物因低溫脅迫引起的傷害中起著重要的作用[2]，還可減緩干旱脅迫、銅脅迫等逆境對作物的傷害[3-4]。黃瓜幼苗在鹽脅迫下施用低濃度的外源NO可以減緩其根系的脂質過氧化程度[5]；吳錦程等[6]研究表明，外源NO處理可提高枇杷幼果過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和抗壞可血酸過氧化物酶（APX）的活性，降低枇杷幼果的膜質過氧化程度，增加滲透調節物質的含量，緩解低溫脅迫對枇杷幼果的傷害；外源NO可以通過提高活性氧（ROS）、水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）活性，抑制烏頭酸酶（aconitase）活性，來增強采收后的桃子果實對褐腐病菌的抗性[7]；外源NO能明顯提高黃瓜幼苗葉片的凈光合速率和葉綠素含量，降低膜透性和丙二醛（MDA）含量，減緩低溫對黃瓜幼苗生長的抑制[8]；外源NO可緩解低溫對番茄幼苗的生長抑制作用，提高其根系活力[9]。

豇豆（Vigna unguiculata L.）是豆科豇豆屬豇豆種一年生纏繞草本植物，原產于非洲東北部和印度，中國是其第二起源中心[10]，在我國廣泛栽培。豇豆也是海南主要冬季瓜菜之一，豇豆喜溫，耐熱，不耐低溫，海南冬季易受內陸冷空氣的影響，各地區有害積寒值從0.68 ℃·d到9.05 ℃·d不等[11]。低溫脅迫降低了豇豆種子的萌發率和出芽率[12]，抑制了植株生長，導致酶活性下降[13]，15 ℃以下豇豆不易生長結莢[11]。低溫對豇豆產量及品質的影響極大，常常造成巨大的經濟損失[11-14]。

外源NO供體硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）可緩解低溫脅迫對黃瓜、番茄、枇杷的傷害，但對低溫脅迫下豇豆幼苗生長、生理特征影響的研究鮮有報道，本研究針對豇豆冬春生產中存在的低溫脅迫問題，通過對豇豆幼苗根際施加外源NO，初步探討不同濃度的外源NO對低溫脅迫下豇豆幼苗生長和生理特性的影響，為制定豇豆低溫冷害的有效防御措施提供依據及技術支持，對提高豇豆的抗逆能力具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

以夏寶二號豇豆為試材，購于儋州市紅旗市場。外源NO供體硝普鈉（SNP）由上海化工公司提供。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 挑選飽滿、健康的豇豆種子，溫湯浸種后，播種于50孔育苗穴盤，每穴1粒。放于育苗溫室培養，晝夜溫度18～22 ℃，自然光照，待幼苗2葉1心時，選取整齊一致的幼苗放入光照培養箱中培養，光照強度為72 μmol/（m2·s），溫度8 ℃/8 ℃（晝/夜）。

試驗設6個處理：（1）8 ℃低溫脅迫+蒸餾水處理（CK）；（2）8 ℃低溫脅迫+0.1 mmol/L SNP；（3）8 ℃低溫脅迫+0.5 mmol/L SNP；（4）8 ℃低溫脅迫+1.0 mmol/L SNP；（5）8 ℃低溫脅迫+1.5 mmol/L SNP；（6）8 ℃低溫脅迫+2.0 mmol/L SNP。每處理重復3次，每個重復15株苗，

分別用不同濃度的SNP溶液進行根際處理，對照只澆蒸餾水，低溫脅迫5 d后，取出幼苗植株，測定各項指標，生理指標測定采用完全展開的第2片真葉。

1.2.2 項目測定 用鋼卷尺測量（精確到1 mm）幼苗的株高（莖基部到生長點），用游標卡尺測定莖粗、下胚軸長（胚乳節以下至根頸部分）；用電子天平稱量鮮重；將鮮樣置于110 ℃烘箱中殺青10 min 后調至75 ℃烘至恒重，稱重；葉面積的測定：使用手持式激光葉面積儀（Laser Area Meter CI-203）對葉片直接測量；含水量=（鮮重-干重）/鮮重×100%，根冠比按地上部分和地下部分分開取鮮樣，烘干后稱重；壯苗指數=（莖粗/株高+地下部重/地上部重）×干重[15]。

采用茚三酮法測量脯氨酸含量[16]；采用硫代巴比妥酸比色法測定丙二醛的含量[17]；采用考馬斯亮藍G-250染色法對可溶性蛋白的含量進行測定[16]；每個處理隨機均勻取3片葉片，每個葉片取5個不同的點，分別用葉綠素含量測定儀SPAD-502進行測量，并記錄每個點測得的葉綠素含量的相對值（SPAD值）。

1.3 數據統計與分析

使用Microsoft Excel 2013進行數據統計與分析；使用DPS 7.05軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 外源NO對低溫脅迫下豇豆幼苗生長的影響

表1為低溫脅迫下SNP對豇豆幼苗形態指標的影響，不同濃度SNP處理對低溫脅迫的緩解作用不同。0.1 mmol/L處理對株高、莖粗、葉面積、干重的影響不大，相比對照下胚軸長、含水量、根冠比及壯苗指數提高，而1.0～2.0 mmol/L SNP對株高、莖粗、下胚軸長、干重相較于對照均降低，根冠比、葉面積和壯苗指數均提高。處理0.5 mmol/L SNP的株高、莖粗和下胚軸長分別為12.07、0.27和4.87 cm，高于對照和其他處理，但差異未達顯著水平。處理0.5 mmol/L SNP的葉面積最大，為17.62 cm2，極顯著高于對照和其他處理，但隨著施用SNP濃度的增加，豇豆幼苗的葉面積并沒有持續增長。處理0.5 mmol/L SNP的根冠比和壯苗指數最大，分別為0.39和0.78，分別比對照提高了77.27%和136.36%，相對于對照及其他處理，差異達極顯著。各處理間豇豆幼苗的干重和含水量與對照相比，未達顯著性差異。

綜上所述，不同濃度的SNP對低溫脅迫下豇豆幼苗的生長影響不同，但0.5 mmol/L SNP處理可緩解低溫脅迫對豇豆幼苗的生長抑制。

2.2 外源NO對低溫脅迫下豇豆幼苗生理特性的影響

2.2.1 外源NO對低溫脅迫下豇豆幼苗脯氨酸含量的影響 由圖1可知，施用SNP可以不同程度提高低溫脅迫下豇豆幼苗體內脯氨酸含量。5個處理的脯氨酸含量分別比對照處理提高了24.57%、43.10%、22.41%、9.91%、5.17%，處理0.1 mmol/L SNP、0.5 mmol/L SNP和1.0 mmol/L SNP脯氨酸含量與對照差異都達到極顯著水平，處理1.5 mmol/L SNP和2.0 mmol/L SNP脯氨酸含量與對照間差異未達顯著水平，由此可知，0.5 mmol/L SNP對豇豆幼苗脯氨酸含量的影響效果最佳，過高濃度的SNP會抑制豇豆幼苗脯氨酸的積累。

2.2.2 外源NO對低溫脅迫下豇豆幼苗可溶性蛋白含量的影響 從圖2可以看出，施用SNP可以提高低溫脅迫下豇豆幼苗的可溶性蛋白含量，0.1、0.5、1.0 mmol/L SNP處理可溶性蛋白含量分別比對照增加了20%、40%、40%，與對照差異達顯著水平。1.5、2.0 mmol/L SNP處理豇豆幼苗可溶性蛋白含量和對照無顯著性差異。說明0.5 mmol/L SNP和1.0 mmol/L SNP可提高低溫脅迫下豇豆幼苗可溶性蛋白含量，高濃度SNP對低溫脅迫下豇豆幼苗可溶性蛋白的積累作用不大。

2.2.3 外源NO對低溫脅迫下豇豆幼苗丙二醛含量的影響 由圖3可知，0.5～2.0 mmol/L SNP處理后，豇豆MDA含量均降低。各處理中，0.5 mmol/L SNP處理的MDA含量減少了12.98%，緩解低溫脅迫的效果最好，與對照差異達顯著水平；1.5 mmol/L SNP處理的MDA含量減少了7.86%，2處理在不同程度上可以緩解低溫脅迫對幼苗細胞膜的傷害。但0.1 mmol/L SNP處理的MDA含量提高12.60%，過低濃度的SNP不能抑制豇豆幼苗的MDA積累。

2.2.4 外源NO對低溫脅迫下豇豆幼苗葉片中葉綠素含量的影響 從圖4可知，施用SNP可以提高低溫脅迫下豇豆幼苗葉片的葉綠素含量，0.1～1.0 mmol/L SNP處理均可顯著緩解低溫對葉的傷害，其葉綠素含量分別為37.00、39.28、37.17，分別比對照增加4.40%、10.84%、4.88%，與對照差異達顯著水平。1.5 mmol/L SNP、2.0 mmol/L SNP處理葉片葉綠素含量與對照相比未達顯著性差異。說明0.5 mmol/L SNP處理對低溫脅迫下豇豆幼苗葉片葉綠素含量緩解效果最好。

3 討論與結論

張瑜[18]的研究結果表明，低溫脅迫下，豇豆幼苗的光合色素、可溶性糖和可溶性蛋白質等含量明顯降低，MDA含量升高；樊懷福等[19]的研究結果表明，低溫脅迫使黃瓜幼苗的干重、鮮重、葉綠素含量等形態指標顯著下降，膜透性和MDA含量等生理指標顯著增加。近年來，NO作為植物生長調節的信號分子，與植物非生物脅迫間關系受到普遍關注。

3.1 外源NO對低溫脅迫下豇豆幼苗形態指標的影響

低溫極易造成植株生長發育受阻，形態指標可以反映植株幼苗的生長狀況[15]，如較大的葉面積可以增加植株的光合作用；根冠比能反映出植物地上、地下部生長發育情況，高則根系機能活性強，低則弱[20]。于秀針等[9]研究發現，施加外源NO可以增加低溫下番茄幼苗的株高、莖粗、葉片數，提高鮮重、干重，1.0 mmol/L SNP處理對其生長指標影響效果最好。由本試驗研究結果可知，在低溫脅迫條件下，適當濃度的外源NO促進了豇豆幼苗的株高、莖粗、下胚軸長和葉面積生長，提高了豇豆含水量、干重、根冠比和壯苗指數，從葉面積、根冠比及壯苗指數幾個指標來看，0.5～1.0 mmol/L處理顯著高于對照。施用過高或過低濃度的外源NO會抑制豇豆幼苗的生長。外源NO對豇豆幼苗的株高、莖粗、下胚軸長、含水量、干重的影響和對照相比未達到顯著水平，可能與低溫脅迫時間較短有關系，在下一步的實驗當中可適當延長脅迫時間。另外，對比番茄試驗與本次豇豆試驗可知，在低溫脅迫時，外源NO可以使植物幼苗生長更加良好，說明外源NO提高了植物幼苗的抗冷性；豇豆幼苗在0.5 mmol/L時生長最好，而番茄幼苗在1.00 mmol/L時生長最好，說明因植物種類不同，緩解低溫脅迫的最適外源NO濃度也不一致，因此不同植物利用外源NO降低低溫脅迫的影響時，需要進行前期實驗。

3.2 外源NO對低溫脅迫下豇豆幼苗脯氨酸和可溶性蛋白含量的影響

植物在低溫脅迫下，脯氨酸和可溶性蛋白是重要的滲透調節物質，作為防脫水劑保護植物，其含量增加，可增強細胞或組織的持水能力，對生物膜起到保護作用，增強植物抗寒性[21]。楊美森等[20]研究發現，經SNP處理的棉花幼苗脯氨酸和可溶性蛋白含量的上升可以增強棉花幼苗的抗冷性。本研究結果發現，SNP可以提高低溫脅迫下豇豆幼苗的Pro和可溶性蛋白含量，0.5 mmol/L SNP處理豇豆幼苗的Pro和可溶性蛋白含量最高，表明Pro和可溶性蛋白質含量增加，細胞的滲透勢得到調節，提高了豇豆幼苗的耐冷性。

3.3 外源NO對低溫脅迫下豇豆幼苗丙二醛含量的影響

丙二醛（malondialdehyde）是膜脂過氧化作用的主要產物之一，常作為質膜過氧化作用的主要指標，低溫脅迫可引發或加劇細胞的膜脂過氧化作用，植物抗寒性與MDA含量呈負相關[22]。吳錦程等[6]研究認為，低溫脅迫可引發或加劇枇杷幼果細胞膜脂過氧化作用，致使MDA含量增加，SNP處理能有效降低低溫脅迫下枇杷幼果的MDA含量，緩解低溫脅迫對枇杷幼果的膜脂過氧化損傷程度。本研究結果表明，SNP處理可以抑制低溫脅迫下豇豆幼苗MDA的產生，緩解冷害脅迫下膜質過氧化作用對細胞的傷害。

3.4 外源NO對低溫脅迫下豇豆幼苗葉綠素含量的影響

葉綠素（chlorophyll）是一類與光合作用（photosynthesis）有關的最重要的色素，在光合作用中起著吸收、傳遞和轉化光能的重要作用[23]。低溫脅迫下，植物葉綠體類囊體膜的膜質組分和膜蛋白發生改變，類囊體的超微結構受到破壞，引起膜質的過氧化，光合速率下降[24-25]。吳錦程等[6]、楊美森等[20]研究結果表明，噴施SNP能提高低溫脅迫下植株葉片的葉綠素含量，這與本試驗的研究結果一致。這可能是因為低溫脅迫下，葉綠體結構破損，合成葉綠素含量減少，而SNP具有強氧化性的活性氮，能夠促進葉綠體結構的修復，提高葉綠素的含量，因而提高豇豆幼苗抗冷害能力[26]。

綜上所述，在低溫脅迫下，外源NO可以增加豇豆株高、莖粗、葉面積、壯苗指數和豇豆生物量，并能夠提高豇豆幼苗Pro、可溶性蛋白和葉綠素含量，降低丙二醛含量，從而增強豇豆幼苗對低溫脅迫的適應性。

參考文獻

[1] Besson-Bard A， Pugin A， Wendehenne D. New insights into nitric oxide signaling in plants[J]. Annu Rev Plant Biol， 2008， 59： 21-39.

[2] Siddiqui M H， Al-Whaibi M H， Basalah M O. Role of nitric oxide in tolerance of plants to abiotic stress[J]. Protoplasma， 2011， 248（3）： 447-455.

[3] Garcia-Mata C， Lamattina L. Nitric oxide induces stomatal closure and enhances the adaptive plant responses against drought stress[J]. Plant Physiology， 2001， 126（3）： 1 196-1 204.

[4] Hu K D， Hu L Y， Li Y H， et al. Protective roles of nitric oxide on germination and antioxidant metabolism in wheat seeds under copper stress[J]. Plant Growth Regulation， 2007， 53（3）： 173-183.

[5] Shi Q， Ding F， Wang X， et al. Exogenous nitric oxide protect cucumber roots against oxidative stress induced by salt stress[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2007， 45（8）： 542-550.

[6] 吳錦程， 陳偉建， 蔡麗琴， 等. 外源NO對低溫脅迫下枇杷幼果抗氧化能力的影響[J]. 林業科學， 2010， 46（9）： 73-78.

[7] Shi J Y， Liu N， Gu R X， et al. Signals induced by exogenous nitric oxide and their role in controlling brown rot disease caused by Monilinia fructicola in postharvest peach fruit[J]. Journal of General Plant Pathology， 2015， 81（1）： 68-76.

[8] 徐洪雷， 于廣建. 一氧化氮NO對黃瓜低溫脅迫的緩解作用[J]. 東北農業大學學報， 2007， 38（5）： 606-608.

[9] 于秀針， 張彩虹， 姜魯艷， 等. 外源NO對低溫脅迫下番茄種子萌發和幼苗生長的影響[J]. 北方園藝， 2014（22）： 5-8.

[10] 呂家龍主編. 蔬菜栽培學各論[M]. 北京： 中國農業出版社， 1980.

[11] 張 蕾， 霍治國， 黃大鵬， 等. 海南冬季主要瓜菜寒害風險區劃[J]. 中國生態農業學報， 2014， 22（10）： 1 240-1 251.

[12] 張獻英， 唐力生， 猶昌艷， 等. 低溫對豇豆種子萌發和出苗的影響[J]. 南方農業學報， 2013， 44（11）： 1 785-1 790.

[13] 彭永康， 郝泅城， 王振英. 低溫處理對豇豆幼苗生長和POD、COD、 ATPase同工酶的影響[J]. 華北農學報， 1994， 9（2）： 76-80.

[14] 梁偉紅， 羅 微， 劉燕群， 等. 海南冬季瓜菜產業風險及可持續發展對策研究[J]. 江蘇農業科學， 2013， 41（10）： 431-433.

[15] 別之龍， 黃丹楓， 等. 工廠化育苗原理與技術[M]. 北京： 中國農業出版社， 2008.

[16] 李合生. 植物生理生化實驗原理和技術[M]. 北京： 高等教育出版社， 2000.

[17] 張志良. 植物生理實驗指導[M]. 北京： 高等教育出版社， 2000.

[18] 張 瑜. 環境因子對豇豆光合特性和若干生理生化指標的影響[D]. 福州： 福建農林大學園藝學院， 2010.

[19] 樊懷福， 杜長霞， 朱祝軍. 外源NO對低溫脅迫下黃瓜幼苗生長、 葉片膜脂過氧化和光合作用的影響[J]. 浙江農業學報， 2011， 23（3）： 538-542.

[20] 楊美森， 王雅芳， 干秀霞， 等. 外源一氧化氮對冷害脅迫下棉花幼苗生長、 抗氧化系統和光合特性的影響[J]. 中國農業科學， 2012， 45（15）： 3 058-3 067.

[21] 馮兆忠， 王 靜， 馮宗煒. 三哇酮對黃瓜幼苗生長及抗寒性的影響[J]. 應用生態學報， 2003， 14（10）： 1 637-1 640.

[22] 劉祖祺， 張石城. 植物抗性生理學[M]. 北京： 中國農業出版社， 1994.

[23] Li X G， Meng Q W， Jiang G Q， et al. The susceptibility of cucumber and sweet pepper to chilling under low irradiance is related to energy dissipation and water-water cycle[J]. Photosynthetica， 2003， 41（2）： 259-265.

[24] 許 楠， 孫廣玉. 低溫鍛煉后桑樹幼苗光合作用和抗氧化酶對冷脅迫的響應[J]. 應用生態學報， 2009， 20（4）： 761-766.

[25] Taylor A O， Craig A S. Plants under climatic stress II. Low temperature， high light effects on chloroplast ultrastructure[J]. Plant physiology， 1971， 47（5）： 719-725.

[26] 敬 巖， 孫寶騰， 符建榮. 一氧化氮改善鐵脅迫玉米光合組織結構及其活性[J]. 植物營養與肥料學報， 2007， 13（5）： 809-815.