南瓜種質資源遺傳多樣性的SRAP分析

盧麗芳　朱海生　溫慶放　林義章

摘 要 本研究應用SRAP分子標記技術對所收集的85份南瓜資源進行親緣關系分析，從100對引物中挑出17對引物對其進行條帶擴增。結果表明：共獲得條帶200條，差異帶有187條，13條條帶為所有南瓜品種所共有，多態性比例為93.5%。基于SRAP數據通過Ntsys2.10e軟件計算出85份南瓜資源的遺傳相似系數在0.450 0～0.985 0。通過聚類分析將所收集的南瓜資源分為3大類：中國南瓜、印度南瓜、美洲南瓜，親緣關系較近的是中國南瓜與美洲南瓜，二者與印度南瓜的親緣關系較遠。

關鍵詞 南瓜；SRAP；親緣關系；聚類分析

中圖分類號 S642.1 文獻標識碼 A

Analysis of Genetic Diversity in Squash by SRAP Markers

LU Lifang1，ZHU Haisheng2，3，4*，WEN Qingfang2，3，4*，LIN Yizhang1

1 College of Horticulture，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002，China

2 Crops Research Institute，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou，Fujian 350013，China

3 Vegetable Research Center，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou，Fujian 350013，China

4 Fujian Engineering Research Center for Vegetables，Fuzhou，Fujian 350013，China

Abstract In this study，SRAP was used to analyse the genetic relationship of 85 accessions in squash. Seventeen pairs of primers were screened out of 100 primer pairs which produced 200 DNA bands， with 187 bands of polymorphic and 13 bands for all squash. The ratio of polymorphic bands was 93.5%. Based on the SRAP data，the genetic similarity coefficient of 85 accessions in squash was between 0.450 0 to 0.985 0， which was calculated by Ntsys2. 10e. Through cluster analysis，Squashes were divided into three groups：Cucurbita moschata，C. maxima，C. pepo. The relationship of C. moschata and C. pepo were close，the kinship with the C. maxima was far.

Key words Squash；SRAP；Genetic relationship；Cluster analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.12.006

南瓜屬（Cucurbita L）葫蘆科南瓜屬的一年生草本植物，起源于美洲，在16世紀中葉明中期傳入中國[1]。南瓜全球目前栽培種主要有5個：分別是中國南瓜，印度南瓜，美洲南瓜，灰籽南瓜和黒籽南瓜，在中國主要是栽培前3種。南瓜是人類最早栽培的古老作物之一，在公元前4050年就開始了美洲南瓜的栽培，公元前5000～3000年就有了中國南瓜和墨西哥南瓜的殘片存在[2]。據統計，中國已經入庫保存的南瓜份數總共有1 813份，其中中國南瓜1 064份，印度南瓜357份，美洲南瓜389份，黑籽南瓜占3份[3]。由于地區間相互引種、種子公司自繁自育、農民自繁自育，導致市場上南瓜品種的名稱眾多，同名異物或同物異名的情況頻繁出現，給南瓜種質資源的收集工作和南瓜的育種工作造成困難。因此對于育種工作者來說，種質資源收集完成后，通過對收集的資源進行系統的評價分析，才能夠更加明確需要選擇的育種親本，實現相應的育種目標。

SRAP（sequence-related amplified polymorphism）又稱為相關序列擴增多態性，2001年由美國加州蔬菜作物系的Li等[4]發明的，是一種基于PCR反應的新型標記系統，具有多態性高、樣品信息量大、操作簡便、重復穩定、可靠性高、費用低、非等位檢測的優點[5]。其原理是通過對富含GC堿基的外顯子和富含AT的內含子及啟動子的ORF（開放式閱讀框）設計一對獨特的引物進行特異性擴增，從而表現出多態性[6]。為了從分子水平上了解南瓜種質資源的遺傳多樣性，人們已經用RAPD[7-11]、ISSR[10-11]、AELP[12]對遺傳多樣性進行分析。關于利用SRAP分子標記對南瓜種質資源遺傳多樣性進行研究的報道較少，劉小俊等[13]利用SRAP對收集的76份南瓜資源進行遺傳多樣性分析。本研究在廣泛收集南瓜種質資源、優化南瓜SRAP擴增體系的基礎上[14]，對所收集到的85份南瓜種質資源進行遺傳多樣性分析，建立遺傳聚類圖，鑒定品種間的親緣關系，為南瓜種質資源的鑒定、分類和南瓜的育種工作提供相應的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料共85份，見表1。包括中國南瓜，印度南瓜和美洲南瓜3個栽培種。材料來源于全國各地。

1.2 方法

1.2.1 供試南瓜DNA的提取 參考盧麗芳等[14]的方法。

1.2.2 PCR反應及電泳 反應在PCR儀上進行，擴增反應體系為20 uL，其中包括0.2 mmol/L dNTP，1.5 U Taq酶，80 ng DNA，0.16 umol/L的單條引物，1.5 mmol/L的Mg2+，2 uL 10×Buffer。擴增程序：94 ℃ 5 min預變性；接著進入5個循環，包括94 ℃ 1 min，35 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min；然后進入35個循環，包括94 ℃ 1 min，52 ℃ 1min，72 ℃ 1 min；最后72 ℃延伸10 min。將擴增產物用1.8%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，電泳緩沖液為1×TBE，采用DL 2 000 DNA Marker作為標準分子量對照，電泳時間45 min。電泳完成后，在EB中染色10 min左右，放入到凝膠成像分析系統中觀察、拍照。

1.2.3 數據統計 根據所獲得的電泳圖進行數據的統計和處理。電泳圖中的每一條帶代表著模板DNA和引物之間的一個結合位點，根據DNA擴增結果，進行人工計數，統計不同品種之間有重復性的多態性擴增條帶，有條帶的記為1，沒有條帶的則記為0，從而形成由0和1組成的原始矩陣。采用Ntsys2.10e軟件進行數據處理，獲得相應的相似系數表和樹狀聚類圖。

2 結果與分析

2.1 引物篩選

通過選用外觀形狀差異較大的5個南瓜品種對100對引物進行篩選，選出13條引物（表2）將其用于南瓜SRAP分析，其中上游引物6條，下游引物7條。組成17對多態性高、重復性好、條帶清晰的SRAP引物，以此對85份南瓜材料進行SRAP遺傳多樣性分析，結果見表3。

2.2 17對引物的SRAP擴增結果

由表3可知，17對引物共擴增出條帶200條，平均每個引物擴增出條帶11.76條，其中差異帶有187條，13條條帶為所有南瓜品種所共有，多態性比例為93.5%。其中ME7EM1組合擴增條帶數最多，達到17條，多態性為100%，見圖1。ME6EM9擴增條帶數最少，為8條，差異帶有7條，多態性為87.5%。17對引物擴增條帶的多態性，最高為100%，最低為77.78%。結果表明，南瓜種質資源的遺傳多樣性很高，同時也表明了SRAP分子標記能夠很好地檢測南瓜種質資源的遺傳多樣性。

由表4可知，3個栽培種的種內多態性高低順序為：印度南瓜>中國南瓜>美洲南瓜，分別為51.5%、 45%、31.5%。而種間兩兩多態性為：中國-印度南瓜為78.5%，中國-美洲南瓜為76%，印度-美洲南瓜為81.5%。

2.3 85份南瓜聚類結果

基于SRAP數據通過Ntsys2.10e軟件計算出85南瓜資源的遺傳相似系數。85份南瓜遺傳相似系數在0.450 0～0.985 0，平均為0.7155。其中材料10與材料83的遺傳相似系數最小（為0.450 0），說明材料10與材料83的親緣關系最遠。材料52與材料54的遺傳相似系數最大（為0.985 0），說明材料52與材料54的親緣關系最近。

采用Ntsys2.10e軟件對85份南瓜資源親緣關系進行SRAP分析。根據圖2可知，在遺傳相似系數為0.616 0處，可將南瓜分為3大類，分別是中國南瓜、印度南瓜、美洲南瓜。親緣關系較近的是中國南瓜與美洲南瓜，2類南瓜與印度南瓜的親緣關系較遠。

第一類：中國南瓜（41份），包括密本南瓜特別種（1）、原種密本南瓜（2）、夷香密本（4）、密本南瓜（5）、密本南瓜（3）、密本南瓜（6）三明圓南瓜（26）、密本2號（11）、本地南瓜子（33）、大金鉤南瓜（14）、永定南瓜1號（28）、永定南瓜2號（29）、青豐金鉤南瓜（15）、無蔓一號（19）、新無蔓一號（20）、武夷山南瓜本地種3號（32）、廬豐安3（34）、密本南瓜（7）、密本南瓜（8）、密本南瓜王（9）、南瓜子（37）、無蔓一號（64）、金勾南瓜（49）、五月早南瓜（47）、 金密南瓜（48）、一串鈴一號南瓜（51）、金鉤南瓜（13）、三明長南瓜（27）、武夷山南瓜本地種2號（30）、武夷山南瓜本地種1號（31）、黑密南瓜（57）、世龍金密南瓜（63）、圓形種（36）、密本南瓜（12）、江西農家種（25）、庭院南瓜（16）、星早南瓜（17）、中夏南瓜1號（60）、中夏南瓜2號（61）、一串鈴1號南瓜（花皮）（44）、蜜棗南瓜（998）（45）。

第二類：美洲南瓜（17份），有晶珠早南瓜（70）、美國綠丹（71）、西葫蘆早青一代（74）、新早青一代（75）、湘葫一號（76）、雪玉（85）、西葫蘆（77）、滿田雅綠（84）、金珠（82）、碧珠（78）、京珠（79）、京香蕉（80）、金榜（81）、京葫一號（83）、長型南瓜（35）、晶瑩翠（72）、改良早青一代（73）。

第三類：印度南瓜（27份），有日本南瓜（23）、甜面大南瓜（46）、日本紅栗（40）、短蔓紅栗（42）、密本南瓜（10）、巨型南瓜（18）短蔓紅（21）、短蔓紅（22）、進口紅栗（41）、日本甜栗（38）、日本甜栗（39）、 日本南瓜（24）、 勝栗（52）、 君川金栗（54）、謝花面南瓜（56）、 黑蜜寶（53）、 黑冠軍（55）、 綠皮南瓜F1（62）、 李白（65）、 早熟京綠栗（66）、 紅板栗（67）、 韓香栗（68）、 迷你貝貝（58）、 臺友紅南瓜（59）、 短蔓京綠栗（43）、 紅栗南瓜（50）、 京銀栗南瓜（69）。

3 討論與結論

SRAP分子標記在蔬菜[15-17]、花卉[18]、果樹[19]的親緣關系鑒定和遺傳多樣性分析上應用廣泛，在南瓜上應用不多。僅劉小俊等[13]利用SRAP分子對南瓜種質資源遺傳多樣性進行分析，結果表明SRAP分子標記將76份南瓜材料分為3大類，分別是中國南瓜、美洲南瓜和印度南瓜。劉小俊等[8]應用RAPD分子標記對30份在中國栽培的南瓜進行遺傳多樣性分析，分類結果與其應用SRAP標記獲得的分類結果一致。李俊麗等[9]對70份南瓜的遺傳多樣性進行RAPD分析，結果將其分為3類，分別是中國南瓜、印度南瓜、美洲南瓜，認為親緣關系最近的是中國南瓜和美洲南瓜，但2類南瓜與印度南瓜的關系較遠。張天明[12]對4個南瓜屬栽培種進行AFLP分析，聚類結果能夠將4個栽培種分開，且美洲南瓜與黑籽南瓜關系較近，兩者與中國南瓜的親緣關系稍遠，三者與印度南瓜的關系最遠。趙福寬等[7]應用RAPD分子標記對76份南瓜進行親緣關系分析，分類結果與劉小俊等[13]、李俊麗等[9]的分類結果一致，并認為中國南瓜、印度南瓜、美洲南瓜3個栽培種的種間差異明顯。此外，肖祖梅[10]應用RAPD和ISSR分子標記對觀賞南瓜進行遺傳多樣性分析，楊正安等[11]應用ISSR和RAPD分子標記對云南黑籽南瓜進行親緣關系分析。除了應用分子標記對南瓜的親緣關系和遺傳多樣性進行分析外，形態學標記、細胞學標記和同工酶標記在南瓜上也有應用，如李俊麗[20]對70份南瓜資源的45個植物學性狀進行鑒定，通過聚類，將70份南瓜分為3大類群，分別是中國南瓜、美洲南瓜和印度南瓜，且美洲南瓜與中國南瓜的親緣關系最近，印度南瓜與中國南瓜、美洲南瓜與印度南瓜的關系稍遠。巴林[21]對南瓜F1代雜種的一價染色體和細胞二價染色體進行比較，認為中國南瓜和美洲南瓜的親緣關系最近，與印度南瓜的關系次之。孫正海等[22]對中國南瓜、美洲南瓜、印度南瓜的41個品種進行過氧化物同工酶分析，聚類分析表明中國南瓜和美洲南瓜親緣關系近，兩者與印度南瓜的關系較遠。

本研究對100對SRAP引物進行篩選，挑出17對引物進行擴增，獲得擴增條帶200條，其中差異帶187條，多態性比例為93.5%，表明所收集的南瓜種質資源的遺傳基礎范圍較廣。從種間差異來看，印度-美洲南瓜>中國-印度南瓜>中國-美洲南瓜。從種內差異來看，印度南瓜>中國南瓜>美洲南瓜，這一結果與孫正海等[22]對中國南瓜、美洲南瓜、印度南瓜的41個品種進行過氧化物同工酶分析獲得的結果不一致，孫正海等[22]認為中國南瓜種內差異最大，印度南瓜種內差異最小。通過聚類分析，將收集的85份南瓜分為3大類，分別是中國南瓜、印度南瓜、美洲南瓜，親緣關系較近的是中國南瓜和美洲南瓜，它們與印度南瓜的親緣關系則較遠。分類結果與劉小俊[8、13]、李俊麗[9]、張天明[12]、趙福寬等[7]應用RAPD、SRAP、AFLP分子標記技術得到的結果一致，與形態學標記、細胞學標記和同工酶標記獲得的結果也一致。

由于市場上南瓜品種名稱眾多，同名異物或異物同名的現象嚴重，加上地區間的引種頻繁，對育種工作造成困難。如本研究中，10號材料在種質資源收集時，將其歸類為中國南瓜，實驗后，根據聚類樹狀圖，發現其屬于印度南瓜，通過對其田間植株形態、果實外觀特征進行觀察鑒定，確定其為印度南瓜。印度南瓜類群中，52號勝栗與54號君川金栗2個品種名稱不同，但兩者間的遺傳相似系數達到0.985 0，認為二者是同一個品種，即同物異名。中國南瓜類群中，1～9號材料、11號材料、12號材料均命名為密本類南瓜，但相互間的遺傳相似系數存在差異，如1號材料與2號材料間遺傳相似系數最大為0.9800。1號與9號、12號，2號與9號、12號，3號與12號，4號與12號，5號與12號，6號與12號，9號與11號，11號與12號，這些材料間的遺傳相似系數均小于0.900，表明11個密本類南瓜中并非都是密本南瓜，存在同名異物現象。

本研究通過SRAP分子標記，揭示了南瓜種質資源的遺傳多樣性，掌握了不同南瓜栽培種間的遺傳多態性和種內多態性的情況，對所收集的南瓜進行分類，建立了遺傳聚類圖，鑒定了品種間的親緣關系，為南瓜親本的選配和品種選育提供了理論依據

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