巴西橡膠樹HbMET的克隆與表達分析

李輝亮　郭冬　汪晗　楊子平　彭世清

摘 要 通過同源克隆和RACE方法獲得了巴西橡膠樹DNA甲基轉移酶（DNA Methyltransferase， MET）基因（HbMET）。HbMET長4 896 bp，含有4 635 bp的閱讀框架，編碼1 545個氨基酸。蛋白分子量174.36 ku，等電點為6.36。氨基酸序列與可可、毛果楊、黃瓜、擬南芥、碧桃、葡萄和煙草等物種的MET家族成員的同源性分別為73%、77%、74%、56%、72%和68%。進化樹分析表明，HbMET氨基酸序列與毛果楊的MET親緣關系最近。HbMET在巴西橡膠樹的根、樹皮、葉、膠乳中均有表達，其中在膠乳中表達量最低；HbMET在橡膠樹自根幼態無性系的膠乳中表達比老態無性系膠乳中的表達低。

關鍵詞 巴西橡膠樹；自根幼態無性系；DNA甲基轉移酶；表達；DNA甲基化

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A

目前生產中種植的橡膠樹是通過對優良品種嫁接獲得的，由于在嫁接過程中所用的砧木是未經選擇的實生苗，同時嫁接后由于砧木和接穗的相互作用，造成種植的橡膠樹會出現不同個體之間生長的差異和產膠的差異[1-3]。中國學者首次以橡膠樹花藥為外植體通過體細胞發生途徑獲得了再生植株[4-5]。由于再生植株具有自己的根系，擺脫了砧木的影響并恢復了幼態的特性，稱為自根幼態無性系[2，6]。與嫁接苗相比，自根幼態無性系具有生長速度快、干膠產量高、抗逆性強的特點[6-9]。自根幼態無性系與供體（老態無性系）差異產生的原因尚不清楚。以前對差異產生的原因研究主要集中在形態學觀察、排膠生理參數等方面，如樹的莖圍、乳管層數、堵塞指數和黃色體破裂指數、膠乳中糖、無機磷含量和干膠含量等，綜合相關研究結果，自根幼態無性系高產的構成因子主要有：較快的生長速度、較多的乳管列數目、較好的排膠和產膠生理特性[6-9]。本課題組研究發現在自根幼態無性系的膠乳和老態無性系的膠乳中存在一些基因和蛋白的差異表達，初步證實了在自根幼態無性系中膠乳上調表達的基因有95個，下調表達的基因有26個，同時發現在橡膠樹自根幼態無性系中13個蛋白上調表達，11個蛋白下調表達[10-15]。推測這些基因和蛋白的差異表達是自根幼態無性系和老態無性系的產量差異產生的根本原因。橡膠樹自根幼態無性系是由供體通過無性繁殖獲得的，自根幼態無性系和供體的遺傳背景是相同的，所含遺傳物質DNA在堿基序列是相同的，正常條件下橡膠樹的無性繁殖不可能改變遺傳物質DNA的堿基序列，因此自根幼態無性系與其供體差異的產生很可能與表觀遺傳相關。李輝亮[16]證實了橡膠樹自根幼態無性系與供體基因組DNA之間存在甲基化多態性的差異，進一步表明自根幼態無性系與其供體差異的產生與表觀遺傳相關。

表觀遺傳是指不因DNA序列的變化而形成基因功能的改變，這種改變是細胞內除了遺傳信息以外的其他可遺傳物質發生的改變，且這種改變在發育和細胞增殖過程中能穩定傳遞[17]。表觀遺傳的分子機制包括DNA甲基化，組蛋白修飾，染色質改型和小RNA干擾等。甲基化是DNA化學修飾的一種形式，能夠在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表現，是調節基因功能的重要手段[18]。它通過一系列DNA甲基轉移酶來建立和維持DNA甲基化模式[19]。在植物中目前發現至少有MET甲基轉移酶（Methyltransferase， MET）、染色質甲基化酶（Chromomethylase， CMT）和域重排甲基轉移酶（Domains Rearranged Methyltransferase， DRM）3類在結構和功能上不同的胞嘧啶甲基轉移酶[19-27]。為了研究橡膠樹自根幼態無性系高產與DNA甲基化的關系，本課題組對橡膠樹的3類胞嘧啶甲基轉移酶基因進行了克隆和表達分析等相關研究。本研究將報道巴西橡膠樹DNA甲基轉移酶（Methyltransferase， MET）基因（HbMET）的克隆和表達，該結果為進一步研究橡膠樹自根幼態無性系高產與DNA甲基化的關系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）海墾2號自根幼態無性系及其供體老態無性系種植在中國熱帶農業科學院試驗場。所用膠乳的采集按照Tang等[28]的方法進行。根、葉和樹皮采集后用液氮研磨，保存于-70 ℃備用。

1.1.2 質粒、菌種及試劑 3′-full RACE試劑盒和RNA PCR（AMV）Ver.3.0試劑盒購自TaKaRa公司。Taq DNA Polymerase 和T4-DNA連接酶dNTPs、IPTG、X-gal購于Promega公司。E.coli DH5α菌株由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 參照Tang等[28]的方法進行。

1.2.2 HbMET的擴增 根據已報道的植物MET基因家族保守序列設計簡并引物，通過PCR獲得HbMET片段序列，再根據HbMET片段序列設計3′RACE引物。cDNA的合成和3′RACE擴增按照3′-full RACE試劑盒使用說明書進行。實驗所用引物見表1。

1.2.3 HbMET同源性分析和進化樹構建 利用DNAMAN軟件分析HbMET蛋白與其它植物MET家族的同源性和進化樹構建。

1.2.4 HbMET定量PCR分析 以HbACT基因為內參對照，采用SYBR Premix Ex TaqⅡ進行定量PCR分析，基因的相對表達量按BIO-RAD CFX96熒光定量儀使用說明進行分析。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s， 60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，35個循環。PCR引物見表2。

2 結果與分析

2.1 HbMET的克隆

根據已有植物的MET基因家族保守序列設計簡并引物，通過PCR獲得了HbMET的3個片段，分別為1 725 bp（HbMET1）、1 584 bp（HbMET2）和1 525 bp（HbMET3）（圖1）。利用DNAMAN軟件對這3個片段進行拼接。根據拼接獲得的片段設計3′RACE引物，通過3′-RACE擴增技術得到一個551 bp的 3′片段（圖1）。將保守區片段與3′端片段進行拼接，得到一個長4 896 bp的序列（命名為HbMET）。該序列含有4 635 bp的開放式閱讀框架，3′端有248 bp的非編碼區，其中含有一條18個堿基的polyA尾，預測該基因編碼1 545個氨基酸（圖2），分子量174.36 ku，等電點為6.36。

2.2 HbMET生物信息學分析

將HbMET氨基酸序列與其它植物的MET比較，發現HbMET與可可（Theobroma cacao）、毛果楊（Populus trichocarpa）、黃瓜（Cucumis sativus）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、碧桃（Prunus persica）、葡萄（Vitis vinifera）和煙草（Nicotiana tabacum）等物種的MET家族成員的同源性分別達到為73%、77%、74%、56%、72%和68%（圖3）。構建的進化樹表明，HbMET與毛果楊的MET親緣關系最近（圖4）。

2.3 HbMET在自根幼態無性系組織特異性表達

對HbMET在自根幼態無性系的根、皮、花、葉和膠乳中的表達進行了定量PCR分析，結果表明，HbMET在根中的表達最高，其次是在葉和樹皮中表達，膠乳中表達量最低（圖5）。

2.4 HbMET在自根幼態無性系與其供體膠乳的差異表達

天然橡膠是在橡膠樹的乳管中合成的，膠乳實質上是乳管細胞的細胞質[29]。乳管細胞中基因的表達與天然橡膠生物合成直接相關。為了解HbMET在自根幼態無性系與其供體膠乳的表達是否存在差異，對HbMET在自根幼態無性系和其供體膠乳的進行定量PCR分析， 結果表明，HbMET在自根幼態無性系的表達比其供體膠乳的表達低（圖6）。

3 討論與結論

DNA甲基化是最早發現的表觀遺傳修飾途徑之一，大量研究結果表明，DNA甲基化能引起染色質結構、DNA構象、DNA穩定性及DNA與蛋白質相互作用方式的改變，從而控制基因表達[17]。DNA甲基化主要是通過DNA甲基轉移酶家族來催化完成的[19-21]。目前一些植物的MET基因已經克隆并進行了相關研究[21-23]，但是到目前為止還未見橡膠樹MET基因研究的報道。本研究首次從橡膠樹中克隆了MET基因HbMET，同源性和分子進化分析表明，推導的HbMET是一種與植物DNA甲基化相關的甲基化酶。過去關于巴西橡膠樹自根幼態無性系和供體差異產生的原因的研究主要集中在對自根幼態無性系高產構成的形態和生理指標[6-9]，以及膠乳中差異表達基因和蛋白的鑒定[10-15]。而從表觀遺傳的角度來分析自根幼態無性系和供體差異有可能闡明自根幼態無性系高產產生的根本原因。天然橡膠是橡膠樹乳管細胞中合成的，膠乳是乳管細胞的細胞質[29]。本研究結果表明，HbMET在自根幼態無性系膠乳中的表達比其供體膠乳的表達低，可能在自根幼態無性系乳管細胞中DNA甲基化程度較供體乳管細胞的低，DNA甲基化可調控特定的基因表達，而植物啟動子區的DNA甲基化通常抑制轉錄[21-22]。推測由于自根幼態無性系和供體乳管細胞中DNA甲基化的差異，使得自根幼態無性系和供體乳管細胞中基因的表達出現差異，從而導致巴西橡膠樹自根幼態無性系和供體在產膠能力等方面的差異，但這一推測還需進一步深入研究。

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