分子標(biāo)記技術(shù)在辣椒種子純度檢測中的應(yīng)用

楊中周

摘要：種子的純度是種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，其對(duì)產(chǎn)量及品質(zhì)均有直接而明顯的影響。辣椒種子純度鑒定技術(shù)也由傳統(tǒng)的主要依賴形態(tài)鑒定逐步發(fā)展形成集形態(tài)學(xué)鑒定、細(xì)胞學(xué)鑒定、蛋白及同工酶電泳鑒定和遺傳標(biāo)記鑒定等技術(shù)的鑒定技術(shù)體系，特別是基于DNA水平的分子標(biāo)記技術(shù)為種子純度鑒定提供了一個(gè)新的途徑。對(duì)用于辣椒純度鑒定的幾種分子標(biāo)記技術(shù)的基本原理及應(yīng)用進(jìn)行了概述，并全面闡述了各自的優(yōu)缺點(diǎn)，主要包括RFLP、RAPD、SCAR、SSR、ISSR、SRAP、SNP，旨在為辣椒分子純度鑒定提供參考。

關(guān)鍵詞：辣椒；純度檢測；SSR；ISSR；SNP

近年我國辣椒種植面積有130萬hm²之多，僅次于白菜類蔬菜；每年辣椒產(chǎn)量高達(dá)2800萬t，總產(chǎn)值居蔬菜之首。在當(dāng)今辣椒生產(chǎn)中廣泛使用雜交種，而在實(shí)際的制種過程中，由于父母本混雜、母本自交、外來花粉干擾等均影響到種子純度進(jìn)而影響辣椒的品質(zhì)與產(chǎn)量。傳統(tǒng)的種子純度鑒定主要以田間植株的葉形、長勢、幼果鑒定為主，輔以苗期真葉POD同工酶電泳等方式。前者耗時(shí)較長，投入成本較高，而且還常受天氣等因素制約；后者雖然受外界因素影響小，鑒定準(zhǔn)確可靠，但其譜帶少，差異有限，不能夠顯示出不同品種基因型間的差異。自1974年，Grodzicker等發(fā)明了RFLP（Re—striction Fragment Length Polymorphism，限帶性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性）技術(shù)以來，迄今已有20多種分子標(biāo)記技術(shù)相繼問世，部分已應(yīng)用于農(nóng)作物純度的檢測中。

1.限制性酶結(jié)合使用分子雜交技術(shù)的標(biāo)記

1.1RELP（Restriction fragment length polymor-phism，限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性）技術(shù)

這種基于酶切最早用于品種鑒定的第一代分子標(biāo)記技術(shù)，主要通過DNA提取、限制性內(nèi)切酶切割、瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳、southerri印跡雜交、放射自顯影、與標(biāo)準(zhǔn)RFLP指紋比較分析等幾個(gè)步驟對(duì)品種進(jìn)行驗(yàn)雜。RFLP標(biāo)記大多為共顯性標(biāo)記，具有特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)。Livneh等認(rèn)為，RFLP技術(shù)可用于鑒別辣椒雜交種及其親本的種子和幼苗形態(tài)（而同工酶不能鑒別），如利用Hind III/Riho探針43可將雜種Capsicum annuum及其親本鑒別開來。然而其技術(shù)操作繁瑣、難度較大、耗費(fèi)高，不適合大規(guī)模的商業(yè)鑒定，因此2年后Livneh等又將其改造成一個(gè)簡單適用的PCR反應(yīng)。該項(xiàng)技術(shù)的諸多缺點(diǎn)極大地限制了其在種子純度鑒定中的應(yīng)用。

2.經(jīng)PCR擴(kuò)增的標(biāo)記

2.1RAPD標(biāo)記（Randomly Amplified Polymor-phic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA）

該技術(shù)是以PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）為基礎(chǔ)，以長度為9～10bp隨機(jī)寡聚核苷酸為引物對(duì)模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，后經(jīng)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳、溴化乙錠（EB）或銀染鑒定多態(tài)性。該技術(shù)在辣椒雜種鑒定中的研究較為普遍，詹玉絲等研究PCR反應(yīng)的主要影響因子，建立適合辣椒RAPD分析的PCR反應(yīng)體系，并用40個(gè)引物對(duì)‘豫椒968及其親本進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測，篩選出S5、S149、S187等3個(gè)有特異性的引物。在對(duì)以上3個(gè)引物進(jìn)行重復(fù)篩選后，確定S149能用于此辣椒品種純度鑒定，用該引物擴(kuò)增、電泳鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果完全吻合。柳李旺等用91個(gè)寡核苷隨機(jī)引物擴(kuò)增‘02-16及其親本，但親本與雜交后代間差異不明顯，但通過引入外來品種，發(fā)現(xiàn)外來種與‘02-16有明顯區(qū)別，確定此類引物可以鑒定外來品種引起的機(jī)械混雜。經(jīng)篩選引物N5能在父母本之間擴(kuò)增出的特異帶存在著明顯區(qū)別，認(rèn)為該引物可用于鑒定真雜種和由于母本自交引起的假雜種及外來品種的機(jī)械混雜。用該引物對(duì)代純度鑒定與田間鑒定、種子貯藏蛋白質(zhì)鑒定、苗期真葉POD同工酶分析結(jié)果基本一致。李智軍等針對(duì)‘廣椒6號(hào)及親本，從340個(gè)RAPD隨機(jī)引物中篩選出用于反交種的純度鑒定的偏母型引物5個(gè)，用于正交種鑒定的偏父型引物4個(gè)，可用于正反交種兩者純度檢測的互補(bǔ)型引物6個(gè)。利用偏父型引物F05、105和互補(bǔ)型引物F15進(jìn)行純度檢測，3個(gè)引物的檢測結(jié)果不但一致，而且與田間形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果吻合。黃三文等篩選出12個(gè)可用于‘中椒系列雜交種純度鑒定的RAPD標(biāo)記。Hulya的研究也證實(shí)RAPD標(biāo)記在辣椒純度鑒定中的可行性。但由于RAPD受條件影響大，重復(fù)性差，而且一般只表現(xiàn)顯性遺傳，不能有效區(qū)分顯性純合和雜合基因型等缺點(diǎn)，直接限制了其的發(fā)展。

2.2SSR標(biāo)記（Simple Sequence Repeat或Micro-satellite DNA，微衛(wèi)星DNA）

它是由多為1～6個(gè)核苷酸串聯(lián)重復(fù)成100bp以內(nèi)大小的DNA片段。由于微衛(wèi)星位點(diǎn)兩側(cè)的堿基序列較為保守，便于設(shè)計(jì)特定的引物，經(jīng)體外擴(kuò)增后的產(chǎn)物通過電泳技術(shù)進(jìn)行分離，進(jìn)而獲取這些重復(fù)序列的多態(tài)性信息。SSR標(biāo)記多態(tài)性高、結(jié)果重演性和穩(wěn)定性好、操作高度自動(dòng)化、不受環(huán)境影響、每個(gè)位點(diǎn)均有許多等位形式，且呈共顯性遺傳，與顯性遺傳相比，它可分辨出雜交種子的雜合體和純合體，是目前應(yīng)用最為廣泛的分子標(biāo)記技術(shù)，同時(shí)也是被普遍認(rèn)為是最接近理想化的品種鑒定技術(shù)。特別是自2010年我國應(yīng)用SSR分子標(biāo)記開展品種真實(shí)性監(jiān)督抽查以來，越來越多的仲裁機(jī)構(gòu)依靠該技術(shù)進(jìn)行純度檢測，這也促使許多企業(yè)爭相效仿。

劉子記等從辣椒85對(duì)SSR引物中篩選出10對(duì)位于不同染色體上、能在‘熱辣3號(hào)親本間能擴(kuò)增出互補(bǔ)特異性條帶的引物，且均為共顯性標(biāo)記；然后用分別位于2、10、11號(hào)染色體上的多態(tài)性標(biāo)記SSR27、SSR70、SSR76對(duì)196株‘熱辣3號(hào)單株及其親本材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從擴(kuò)增結(jié)果檢測其純度。該檢測結(jié)果與田間表型鑒定結(jié)果高度一致，表明SSR分子標(biāo)記可用于‘熱辣3號(hào)雜交種純度的快速鑒定。張曼利用21對(duì)SSR引物對(duì)辣椒代及其雙親進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選，發(fā)現(xiàn)引物CA885在雙親和F₁代中存在多態(tài)性。且該引物擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定。利用CA885分別對(duì)2份辣椒品種F₁雜交種的96株單株進(jìn)行純度檢測，結(jié)果分別為90.6%和86.0%。與田間純度檢測結(jié)果（分別為90.6%和91.3%）相近或稍低。

2.3SCAR（Sequence Characterized Amplified Regions，特定性片段擴(kuò)增區(qū)域）標(biāo)記

該技術(shù)于1993年由Paran和Michelmore在RAPD基礎(chǔ)上提出，其穩(wěn)定性和可重復(fù)性顯著提高，還具有快速、準(zhǔn)確、成本低的特點(diǎn)，為品種分類與鑒定、假種辨別提供技術(shù)依據(jù)。陳靈芝等利用150條隨機(jī)引物對(duì)‘隴椒5號(hào)及其親本基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，篩選出R520和R780兩條特異性引物，前者為父本和F₁特有標(biāo)記，后者為母本和F₁特有標(biāo)記。對(duì)可鑒別母本和F₁的R520擴(kuò)增片段進(jìn)行回收、克隆、測序，設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物對(duì)試材進(jìn)行擴(kuò)增，鑒定出無條帶的母本或雜株。

2.4ISSR（Inter Simple Sequence Repeat，簡單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性）分子標(biāo)記技術(shù)

該技術(shù)是由Zietkeiwitcz等于1994年基于SSR開發(fā)的、利用引物（SSR序列的3'端或5'端錨定1至數(shù)個(gè)隨機(jī)核苷酸）對(duì)位于反向排列、間隔不太大的重復(fù)序列間的基因組節(jié)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增的一種分子標(biāo)記。該技術(shù)遺傳多態(tài)性高、重復(fù)性好、DNA用量少、無需知道兩端的堿基序列，引物設(shè)計(jì)簡單、呈孟德爾遺傳，已被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)鑒定，然而其在辣椒上的研究鮮有報(bào)道。徐杰從15條引物中篩選出10條重復(fù)性好、條帶清晰、多態(tài)性好的引物，并利用優(yōu)化后的ISSR-PCR反應(yīng)體系對(duì)辣椒F₁代種子的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，電泳圖譜結(jié)果表明，ISSR可以有效地從F₁種中分離出機(jī)械混雜或人工混雜的種子。然而該試驗(yàn)未對(duì)F₁的親本DNA同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增分析，也未對(duì)結(jié)果進(jìn)行后續(xù)田間驗(yàn)證，因而未區(qū)分出真假雜交種和驗(yàn)證結(jié)果的真實(shí)性。

2.5SRAP標(biāo)記（Sequence-Related AmplifiedPolymorphism，相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性）

該技術(shù)由美國加州大學(xué)Li博士等于2001年開發(fā)出的基于PCR對(duì)基因的ORFs（0pen Readinz Frames，開放閱讀框）的特定區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的一種顯性分子標(biāo)記技術(shù)。SRAP的一組由17個(gè)堿基組成的正向引物中使用“CCGG”序列，其目的是使之特異結(jié)合可譯框（ORFS）區(qū)域中的外顯子；SRAP中使用的由18個(gè)堿基組成的反向引物的3'端含有核心AATT，以特異結(jié)合富含AT區(qū)，比如啟動(dòng)子和內(nèi)含子等。這就使得內(nèi)含子與外顯子有可能得到擴(kuò)增。SRAP具有多態(tài)性豐富、引物可以通用等特點(diǎn)，與SSR相比其辨別能力更高、鑒定結(jié)果更接近田間種質(zhì)鑒定，是一種高效的作物品種尤其是雜交種鑒定技術(shù)。扈新民等對(duì)SRAP分子標(biāo)記反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)體系，并以‘杭椒4號(hào)及其父母本為供試材料檢測雜種一代純度，結(jié)果與田間農(nóng)藝性狀調(diào)查驗(yàn)證結(jié)果非常接近。

3.基于單核苷酸多態(tài)性（Single Nugle-otide PolymorphiSill，SNP）的分子標(biāo)記

自1996年Lande首次將SNP作為一種新型分子標(biāo)記提出，該技術(shù)越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的重視，目前已經(jīng)成為最具應(yīng)用前景的分子標(biāo)記。SNP標(biāo)記主要是由單堿基的插入、缺失、轉(zhuǎn)換及調(diào)換等引起的基因組核苷酸序列多態(tài)性，具有二態(tài)性、等位基因性、密度高、遺傳穩(wěn)定、易實(shí)現(xiàn)分析的自動(dòng)化等特點(diǎn)。Jung等篩選出可以用于辣椒品種鑒定的40個(gè)AS-PCR SNP標(biāo)記，從而將81個(gè)商品種中的79個(gè)區(qū)分開來，同時(shí)也能完全區(qū)分出供試的17個(gè)甜椒品種。Jeong等俐用SNP-HRM技術(shù)對(duì)辣椒屬6個(gè)種的31個(gè)成員進(jìn)行辣椒種質(zhì)資源研究，發(fā)現(xiàn)通過對(duì)6種COSII標(biāo)記曲線的結(jié)合比較分析可有效將他們歸到其所屬的種，這與當(dāng)今的分類系統(tǒng)完全吻合，從而表明該項(xiàng)技術(shù)可快速鑒別新種質(zhì)。這些科研成果對(duì)鑒定外來品種的機(jī)械混雜具有一定的借鑒意義，然而應(yīng)用該項(xiàng)技術(shù)對(duì)辣椒真雜種和由于母本自交引起的假雜種的鑒定鮮有報(bào)道。國內(nèi)外該項(xiàng)技術(shù)的研究雖僅限于西瓜、甜瓜與黃瓜，然而這些寶貴的經(jīng)驗(yàn)卻為判斷辣椒種子是否存在親本污染，進(jìn)而測試出供試品種的種子純度的相關(guān)研究創(chuàng)造了條件。

4.應(yīng)用前景與展望

理想的純度檢測方法應(yīng)具備穩(wěn)定性好、技術(shù)簡單、快速、經(jīng)濟(jì)、便于標(biāo)準(zhǔn)化操作等特點(diǎn)。而就目前常用的幾種分子標(biāo)記而言，RFLP操作復(fù)雜，對(duì)DNA質(zhì)量要求高，費(fèi)用較高，放射性同位素對(duì)人體有害；RAPD結(jié)果重復(fù)性較差；SSR引物開發(fā)費(fèi)用高；SNP存在專利問題，對(duì)遺傳統(tǒng)計(jì)的方法及工具要求高，開發(fā)、檢測費(fèi)用大等。均未達(dá)到理想的檢測方法的要求。

2014年1月韓國首爾大學(xué)的Kim等對(duì)墨西哥一個(gè)辣椒栽培變種的全基因組序列和裝配進(jìn)行了報(bào)道，并報(bào)道了2個(gè)栽培辣椒基因序列及一個(gè)野生黃燈籠椒從頭測序序列；在此基礎(chǔ)上獲得首個(gè)高質(zhì)量的參考基因組，并鎖定了負(fù)責(zé)產(chǎn)生辣椒素的基因。同年3月Qin等報(bào)道了遵義市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院選育的品種‘遵辣1號(hào)和一個(gè)墨西哥野生種的全基因組序列。這些在辣椒領(lǐng)域的科研進(jìn)展將會(huì)促使SSR引物開發(fā)費(fèi)用逐漸降低。就ISSR標(biāo)記而言，其引物具有良好通用性，引物設(shè)計(jì)費(fèi)用低。此外，兩者兼具操作簡單、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，使其基本滿足辣椒純度檢測的要求。

近年來，公共序列數(shù)據(jù)庫（NCBI）中大量快速增長的EST（Expressed Sequence Tags，表達(dá)序列標(biāo)簽）序列資源與辣椒多態(tài)性EST-SSR標(biāo)記的位點(diǎn)鑒定及引物研究為SSR標(biāo)記的開發(fā)提供了新途徑。目前EST-SSR分子標(biāo)記技術(shù)已在南瓜、黃瓜、大白菜等作物純度鑒定上成功應(yīng)用。該項(xiàng)技術(shù)具有過程簡單、成本低、在相關(guān)物種間具有較高的可轉(zhuǎn)移性等特點(diǎn)，再加上SSR位點(diǎn)在轉(zhuǎn)錄區(qū)的發(fā)生頻率遠(yuǎn)高于非轉(zhuǎn)錄區(qū)的優(yōu)勢，使得該項(xiàng)技術(shù)更高效，有較好的應(yīng)用前景。同時(shí)隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，海量SNP數(shù)據(jù)被提交至數(shù)據(jù)庫并共享，為建立精確、快速、高通量和高度自動(dòng)化的辣椒種子純度SNP鑒定體系創(chuàng)造了條件。

在實(shí)際工作中，往往要等到供試材料長出葉片后再進(jìn)行提取，而且采用不同的方法（商業(yè)DNA提取試劑盒、CTAB法、SDS法以及其改良后的一些方法）提取的速度及質(zhì)量也略有差異。這些都是制約鑒定效率的重要因素。如果能從干辣椒種子中快速提取DNA并形成標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程和技術(shù)體系，這將大大縮短鑒定所需時(shí)間，提高工作效率。