滇龍膽甲羥戊酸激酶基因的克隆與表達分析

張曉東 李彩霞 趙靜 楊嬌 王元忠

摘 要：甲羥戊酸激酶是甲羥戊酸途徑的關鍵酶。根據滇龍膽轉錄組甲羥戊酸激酶基因GrMK序列，設計一對基因特異性引物克隆該基因，并進行序列分析；構建原核表達栽體pGEX-4T-l-GrMK，轉入大腸桿菌Rosetta（DE3），重組蛋白在37 0C、1.0 mmoVL IPTG誘導下成功表達。生物信息學分析結果表明，GrMK蛋白為甲羥戊酸激酶家族成員，具有MK蛋白保守結構域：乳糖激酶/高絲氨酸激酶/甲羥戊酸激酶/磷酸甲羥戊酸激酶（GHMPkinase）N端結構域、C端結構域和ATP結合結構域；GrMK與長春花CrMK親緣關系最近，原核表達結果表明，融合蛋白相對分子質量與推斷大小一致。組織特異性表達分析結果表明Gr MK基因主要在根中表達.這些結果為GrMK蛋白結構和功能的研究奠定基礎。

關鍵詞：滇龍膽：甲羥戊酸激酶；基因克隆；表達分析

中圖分類號：Q786

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847（2015）03-0196-07

滇龍膽Gentiana rigescens Frach. Ex Hemsl.是傳統中藥龍膽品種之一，是滇產重要道地藥材。滇龍膽也是常用大宗藥材，是龍膽瀉肝片、小兒清熱片和苦膽草片等200多種中成藥的主要成分[1]。近年來，國內外市場對龍膽的需求量在3 000—4 000噸左右，并且醫療用龍膽需求量每年遞增10%左右，市場缺口很大，導致野生滇龍膽資源遭到毀滅性的破壞[1]。滇龍膽的主要藥效成分為龍膽苦苷，要從根本上解決滇龍膽的藥源問題，必須弄清龍膽苦苷生物合成途徑及其調控機制[2]，為龍膽苦苷的異源生物合成奠定基礎。

龍膽苦苷屬于裂環烯醚單萜，在植物中單萜一般是通過胞質甲羥戊酸（MVA）途徑和質體2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP）途徑合成的[3]在長春花MVA途徑中，甲羥戊酸激酶（mevalonatekinase，MK，EC 2.7.1.36）能夠催化ATP中γ磷酸基團轉移到甲羥戊酸C5羥基上，導致甲羥戊酸5-磷酸和ADP的生成[4]，該酶活性取決于二價陽離子Mg2+或Mn2+，其適宜pH為7～10，最適pH為8.9[5]。該酶被認為是萜類生物合成的調控酶[6]。在植物中，甲羥戊酸激酶受下游代謝物反饋抑制，法尼基焦磷酸（ FPP）、異戊烯基焦磷酸（IPP）、DMAPP（二甲烯丙基焦磷酸）和櫳牛兒基焦磷酸（ GPP），甚至植基二磷酸（PDP），均能抑制MK蛋白活性I 7|。目前，甲羥戊酸激酶基因MK已從擬南芥[6]、長春花[8]、丹參[9]、秦艽[10]、三七[11]、杜仲[12]、林煙草[13]等許多植物中分離。Zhuang等將甲烷八疊球菌基因Mm，MyK在大腸桿菌中表達，純化后結晶，并使用X射線衍射技術對晶體結構進行了初步分析[14]。MK基因的表達具有組織特異性，并被生物和非生物因素誘導。在擬南芥中，AtMK基因主要在根和花中表達；啟動子缺失實驗結果表明AtMK基因上游-295至-194區域對于該基因的高表達至關重要[6]。在杜仲中，EuMK3基因啟動子中存在大量的光誘導元件和植物激素誘導元件，因此其轉錄活性可能受光和植物激素的調控[12]。在生物誘導劑（100 mg/mL酵母提取物）和非生物誘導劑（ 30 mmol/L Ag+）共同誘導下，丹參SmMK基因在誘導后12 h表達量達到最高[15]。在乳酸鏈球菌中，共表達MVK和HMGR基因能夠使倍半菲蘭烯（倍半水芹烯）產量加倍[16]。

目前，為選育高產、優質和高抗的龍膽草，云南省已啟動長達7年的龍膽草航天育種工程[17]。但是，由于龍膽基因組資源極度匱乏[18]導致其分子生物學研究進展緩慢。前期作者實驗室分別對滇龍膽的根和葉進行轉錄組測序，本研究基于轉錄組數據庫中Gr MK基因序列，通過RT-PCR技術成功地從滇龍膽幼葉中擴增到GrMK基因，并進行序列分析、原核表達和組織表達特異性分析，以期為滇龍膽主要藥效成分的生物合成及其調控機理的解析提供幫助。

1 材料與方法

1.1植物材料

滇龍膽采自玉溪師范學院分子生物學實驗室的組培苗和盆栽苗，由云南省農業科學院藥用植物研究所金航研究員鑒定為滇龍膽Centiana rigescens Frach.Ex Hemsl.。基因克隆所用材料為滇龍膽無菌苗幼葉，基因表達分析使用材料為盆栽3年生滇龍膽的根、莖和葉，采樣日期為2014年5月17日。

1.2方法

1.2.1 葉片總RNA提取及GrMK基因克隆

按照植物多糖組織提取試劑盒（Takara，大連）說明書提取滇龍膽幼葉總RNA，按照反轉錄試劑盒（Takara，大連）說明書合成cDNA。根據原核表達載體pGEX-4T-l多克隆酶切位點和轉錄組中滇龍膽GrMK基因序列，設計一對特異引物GrMKBamH I-F和GrMKXho I-R（表1）。采用Tran，sTaq DNA Polymerase High Fidelity（2.5 U/μL，Transgene，北京）酶進行擴增，PCR反應條件為：94℃預變性3 min；94 °C變性30 s，55℃退火30 s，72 °C延伸1 min 10 s，30循環；72 °C延伸7 min。PCR產物經1.O%瓊脂糖凝膠電泳分離，割膠后使用膠回收試劑盒（Qiagen，德國）對目的片段進行回收，將其連接到pMD19-T載體上，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞（Takara，大連），涂布于含100 mg/L氨芐青霉素（Takara，大連）+IPTG（Takara，大連）+X-Gal（Takara，大連）的LB固體平板上，37 0C培養13 h后挑取12個白斑，37 0C、250 r/min搖床培養12 h后提取12管質粒，從大小正確的質粒中選取3個，經單雙酶切鑒定正確后進行測序，獲得重組質粒pMD19-Gr MK。1.2.2 GrMK基因原核表達載體構建及原核表達

分別對質粒pGEX-4T-l（實驗室保存）和pMD19-GrMK進行雙酶切、連接，獲得原核表達載體pGEX-4T-l-GrMK。使用熱激法將重組質粒pGEX-4T—l—GrMK轉化大腸桿菌Rosetta（ DE3）感受態細胞（Transgene，北京）后，挑取單菌落接種于3 m_L含100 mg/L氨芐青霉素LB液體培養基中，37 0C、250 r/min培養12 h。然后以1：100比例轉接到無抗生素的LB液體培養基中，37 0C、250 r/min培養3h至A600≈0.8，在37 °C、終濃度為1 mmol/L IPTG誘導下進行表達，同時以相同條件的pGEX-4T-l轉化菌作為對照。分別誘導Oh、2h、4h和6h后收集菌液2 mL。4 °C、8 000 r/min離心1 min，棄上清，加入100 yLddH20、25 yL的5xSDS-PAGE上樣緩沖液，震蕩懸菌，沸水煮5 min。4 °C、13 000 r/min離心5min。取20μL上清上樣，進行SDS-PAGE（5 %濃縮膠和10%分離膠）電泳檢測。

1.2.3 Gr MK基因的生物信息學分析

使用NCBI網站上的BLAST程序進行序列比對，應用Genetyx進行翻譯，使用DNAMAN 7進行多序列比對；用Clustal X2.1進行比對，然后使用MEGA6.0軟件內置的NJ法構建系統進化樹，設置Bootstrap=1 000；利用在線數據庫（http：//molbiol. edu.ru/eng/scripts/Ol_ll.html）進行稀有密碼子分析。使用ChloroP服務器vl.l進行葉綠體轉運肽預測；使用Interpro軟件進行保守結構域預測；使用ProtScalee軟件進行疏水性分析；使用PredictProtein對二級結構進行預測；使用Swiss-Model Workspace自動模式對三級結構進行預測；利用Expasy中的TMHMM工具預測蛋白的跨膜螺旋區；利用在線工具WOLF PSORT預測蛋白的亞細胞定位情況。

1.2.4 GrMK基因的實時定量分析

分別取3年生滇龍膽的根、莖和葉，提取總RNA，使用DNase I處理除去基因組DNA。使用反轉錄試劑盒（Takara，大連）合成第一鏈cDNA。以轉錄組中Gr GA PDH基因（GenBank登錄號KM061807）作為內參設計引物GrGAPDH—F和GrGAPDH-R（表1），PCR反應條件為：95 0C 3 min，95 0C 15 s，60 0C 31 s。根據GrMK基因的ORF序列設計特異性引物GrMK-F和GrMK-R（表1）。使用SuperReal PreMix Plus試劑盒（天根，北京）進行qPCR，PCR反應條件為：95 0C 3 min，95 0C15 s，60 0C 31 s。每個反應重復3次。反應在ABI7000熒光定量PCR儀（Applied Biosystems，USA）上進行擴增，擴增曲線、溶解曲線、標準曲線由定量PCR儀軟件自動生成。使用內參基因Gr GA PDH表達校準后，計算根莖葉中GrMK基因相對表達量。采用比較Ct值的“2-Ana'的方法進行定量數據的分析處理。

2結果與分析

2.1滇龍膽GrMK基因的克隆

以滇龍膽幼葉cDNA為模板，使用特異性引物GrMKBamH I-F和GrMKXho I-R擴增出約1 200 bp的片段。通過TA克隆獲得重組質粒pMD19-GrMK。

2.2 GrMK基因的生物信息學分析

利用Genetyx和DNAMAN軟件對GrMK基因序列進行分析，結果顯示GrMK基因ORF為1 138 bp，編碼387個氨基酸。將該序列上傳至GenBank數據庫，獲得登錄號KJ917167。

使用GenBank數據庫BLASTp程序對GrMK蛋白進行相似性分析，結果表明滇龍膽GrMK與長春花CrMK蛋白序列相似性最高（85.79%），與擬南芥AtMK （67.29%）蛋白相似性較低。利用DNAMAN 7將GrMK蛋白氨基酸序列與NCBI中相似性較高的部分序列進行多序列比對分析，結果表明GrMK蛋白與已知蛋白序列保守性較高（圖1）。利用Mega 6.0將GrMK蛋白與NCBI中相似性較高的部分序列和文獻已報道的部分序列進行系統發育分析，結果顯示滇龍膽GrMK蛋白與長春花CrMK處于同一進化枝（圖2），表明二者親緣關系較近。

使用ProtParam tool對GrMK蛋白進行分析，結果表明GrMK蛋白單體相對分子質量41.12 kD，這與長春花CrMK單體40.50 kD和擬南芥AtMK單體40.70 kD大小相類似[5]；pI為5.34；帶正電氨基酸殘基（Arg+Lys）為30，帶負電氨基酸殘基（Asp+Glu） 為30， 化學方程式為：C1817H2936N476O562S21。不穩定指數為31.22，屬于穩定蛋白；脂肪指數為100.57，總平均疏水性（ GRAVY）為0.21，為疏水蛋白。GrMK蛋白含有20種基本氨基酸，其中亮氨酸和絲氨酸含量最高，均為10.60c/0；其次是丙氨酸和甘氨酸，分別為9.00%和8.800/0；色氨酸含量最低，為1.00%。

利用SSpro方法對GrMK蛋白進行二級結構分析，結果表明該蛋白二級結構中d一螺旋（H）占40.830/0，無規則卷曲（C）占40.31010，延伸帶（E）占18.860/0。利用Swiss-Model Workspace使用自動模式預測GrMK蛋白的三級結構，結果如圖3，該模型以甲烷八疊球古菌甲羥戊酸激酶[4hacA]為模板，在第2-382氨基酸處建模，序列相似度為22.51%。使用InterPro在線工具對GrMK蛋白的保守結構域進行分析，結果表明GrMK蛋白包含5個保守結構域，它們分別為：甲羥戊酸激酶伴乳糖激酶結構域（7-31，136-158，193-212，330-347）、甲羥戊酸激酶結構域（6-384）、乳糖激酶/高絲氨酸激酶/甲羥戊酸激酶/磷酸甲羥戊酸激酶（ GHMP kinase）N端結構域（133-212）、GHMP激酶ATP結合結構域（13 8一149）和GHMP激酶C端結構域（294-350）。

利用SignalP 4.1服務器分析GrMK蛋白，未發現信號肽，表明該蛋白為非分泌型蛋白。利用TMHMM工具預測GrMK蛋白的跨膜螺旋區，結果表明GrMK蛋白不含有跨膜區域（圖4），為非膜蛋白。使用CldoroP在線軟件對葉綠體轉運肽進行預測，結果表明GrMK蛋白不含葉綠體轉運肽。使用WoLF PSORT軟件進行亞細胞定位分析，結果為GrMK蛋白在細胞核、葉綠體和細胞質的定位系數分別為8.0、4.0和2.0，這與文獻報道的MVA途徑存在于細胞質中的結論相矛盾[3]。

對GrMK基因進行稀有密碼子分析，結果表明GrMK基因中稀有密碼子僅占0.78010，且無二聯或三聯稀有密碼子連續出現的情況，因此可選用表達菌BL21或Rosetta （DE3）進行原核表達。

2.3 GrMK基因原核表達載體的構建

使用BamH I和Xho I雙酶切質粒pGEX-4T-1-GrMK，可切出目的片段和載體（圖5），表明Gr MK基因已成功插入載體pGEX-4T-l。

2.4 GrMK基因的原核表達

將重組質粒pGEX-4T-l-GrMK轉化大腸桿菌Rosetta（ DE3）后，進行IPTG誘導表達。在37 0C、終濃度為1 mmol/L IPTG下，分別誘導表達Oh、2h、4h和6h后，提取細菌總蛋白進行SDS -PAGE分析。結果表明，與對照相比，pGEX-4T-l-GrMK轉化菌經IPTG誘導后，在相對分子質量67.12 kD（含GST標簽蛋白26.00 kD）左右有1條蛋白條帶，并且隨誘導時間增加其蛋白含量逐漸增加，表明重組質粒pGEX -4T-1-GrMK在大腸桿菌Rosetta（ DE3）中成功誘導表達了GrMK蛋白。當溫度為37 0C、誘導時間為6h時，蛋白表達量最大（圖6），可直接用于下一步的蛋白純化。

2.5 GrMK基因的組織表達分析

取3年生滇龍膽的根、莖和葉，通過實時定量RT-PCR分析GrMK基因在不同組織中的表達情況。結果表明，GrMK基因在根中表達量最高，約是莖和葉的2倍和485倍；其次是莖，表達量最低的是葉（圖7）。

3討論

MVA途徑能夠為滇龍膽藥效成分龍膽苦苷的生物合成提供前體物質。MK是MVA途徑的第一個限速酶[6，11]，因此，滇龍膽中GrMK基因的表達情況直接或間接影響龍膽苦苷的生物合成。研究表明，植物中MK蛋白如三七PnMVKlc[11]、林煙草NsMKc[13]、杜仲ELIMK[1 2]均包含GHMP激酶N端、C端結構域和ATP結合結構域。本研究從滇龍膽幼葉中克隆了GrMK基因，蛋白序列比對分析結果表明GrMK蛋白屬于MK家族蛋白，在其N端、中部和C端分別具有3個保守結構域：GHMP激酶N端結構域（133-212）、GHMP激酶ATP結合結構域（138-149）和GHMP激酶C端結構域（294-350）。這些結果表明所克隆基因為滇龍膽甲羥戊酸激酶基因。

基因編碼蛋白的活性形式和亞細胞定位對蛋白功能執行都有很大影響。在生物界，MK活性蛋白以單體或二聚體的形式在體內起作用。在詹氏甲烷球菌中，MjMK單體蛋白為36.00 kD，而其活性形式為二聚體，相對分子質量為68.00 kD[19]；在長春花中，其蛋白單體和活性形式相對分子質量分別為40.50 kD和104.60 kD；在釀酒酵母中，其單體蛋白即為其活性形式，相對分子質量為40.80 kDc20]。在本研究中，GrMK單體相對分子質量為41.12 kD.其活性形式需要通過非變性SDS-PAGE進行進一步檢測。在人類、擬南芥和長春花中，MK蛋白均定位于細胞質[3，8，21]。在本研究中，生物信息學分析結果表明GrMK蛋白定位于細胞核的可能性最大，這與三七PnMK蛋白預測結果一致[11]但該結果與其功能作用并不相符，需通過融合GFP標簽進一步驗證其亞細胞定位。在擬南芥整個發育過程中，AtMK基因在各個組織中均表達，但在根分生組織中表達量最高[22]。組織表達特異性檢測結果表明，Gr MK基因在根中表達量最高，因此推測滇龍膽根部為MVA途徑較為活躍，并為龍膽苦苷生物合成提供前體物質。滇龍膽用藥部分為根，因為與葉和莖相比，根中龍膽苦苷含量最高[23]這也為上述假說提供了證據。

本研究為滇龍膽GrMK基因功能的解析奠定基礎。下一步將對GrMK蛋白進行純化和酶活分析，通過互補試驗或過表達研究Gr MK基因功能，為龍膽苦苷生物合成途徑及其調控機理的闡明奠定基礎。