新疆維吾爾族人群過氧化物酶體增殖物激活受體基因相關SNP位點的多態性

祖克拉·肉孜 宋曼殳 布帕提瑪穆·阿布都克熱穆 伊力哈木·乃扎木

多力坤·買買提玉素甫

摘 要：對過氧化物酶體增殖物激活受體基因（PPARG）的31個SNP位點進行群體遺傳學分析，利用質譜檢測技術檢測PPA RG基因的31個SNPs位點多態性，并根據質譜峰圖判讀樣本目標位點基因型，統計分析31個SNP位點的基因型和等位基因的分布頻率，利用x2檢驗確定篩選的SNP位點是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。結果發現31個SNP位點中，23個位點的次等位基因分布頻率MAF≥0.05，在新疆維吾爾族人群中具有多態性，其他8個SNP位點的MAF< 0.05，沒顯示多態性。基因型和等位基因頻率在男女兩組間均無統計學差異（p>0.05），表明這些位點等位基因分布不存在性別差異。

關鍵詞：過氧化物酶體增殖物激活受體（PPA RG）；SNP位點；維吾爾族人群

中圖分類號：Q39

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847（2015）03-0189-07

單核苷酸多態性（single nucleotide polymor-phisms，SNPs）是指人類基因組中單個堿基的變異，推測人類基因組至少有210萬個SNPs[1]。SNPs是人類種族差異、個體差異的分子基礎，成為第三代多態性標記，是基因組多樣性和識別及定位疾病相關基因的一種新型手段[2]。SNPs數量大、分布廣，在人類30億堿基中有約3x106個SNPs位點，在任何已知或未知疾病基因附近都可能找到眾多的SNPs[1]。應用高密度的SNPs圖譜，通過相關分析或連鎖分析可以定位一系列多基因疾病，如糖尿病、高血壓、哮喘、癌癥等的主基因。因此，人們希望通過研究SNP圖譜，更深刻地認識癌癥、糖尿病、血管性疾病和某些精神性疾病等發病率高的多基因疾病的發生機制[2，3]。

過氧化物酶體增殖物激活受體PPA RG基因定位于3p25，屬于轉錄因子的核激素受體超家族，主要表達于脂肪組織，調節脂肪細胞的分化過程，參與脂肪細胞的凋亡，PPA RG基因功能缺失突變可以導致脂肪萎縮，在脂肪細胞特異基因的表達和調節胰島素敏感性方面發揮著重要作用[4]。PPA RG也可能成為肥胖、高血壓、動脈粥樣硬化的新型治療靶點[5-9]。研究提示其可能在脂肪細胞分解、能量消耗及炎癥反應中發揮重要作用[4，10-14]。目前認為PPA RG在人體能量代謝的調節控制中起核心作用，直接影響到葡萄糖進入三羧酸循環、葡萄糖胺生成速率和組織的糖異生能力，經大樣本薈萃分析顯示單核苷酸多態性（SNPs）與2型DM易感性相關[15-19]。

至今雖然在不同種族報道了PPARG基因多態性方面的很多關聯研究，但研究結果不一致，且研究位點多集中于少數幾個常見SNP有報道。為此，本研究探討新疆維吾爾族健康人群PPA RG基因的31個SNP位點的多態性，為進一步研究基因多態性與相關疾病發病危險性和前瞻性研究提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1樣本

采自在新疆地區民豐縣縣醫院體檢的健康維族人群無關個體50例，要求所有調查對象均在所在地區居住3代以上，無血緣關系，年齡>40歲，家庭婚姻史為世代族內通婚。自肘靜脈采血3 mL加0.5 mL ACD抗凝，充分混勻后放人-20°C冰箱冷藏室保存備用。

1.2主要試劑和儀器

基因擴增：ABI Gene Amp@9700 384 Dual，質譜點樣：Mass ARRAY Nan dispenser RS1000；質譜分析：Mass ARRAY Compact System；試劑：Complete Genotyping Reagent Kit for Mass AR-RAY@ Compact 384。

1.3方法及步驟闡述

1）基因組DNA提取及DNA樣品濃度和純度質檢：采用北京Transgenic Biotech有限公司的EasyPureTM Blood Genomic DNA Kit試劑盒。分離出的DNA用瓊脂糖凝膠電泳法檢驗，并通過紫外分光光度計檢測OD260 /OD28080數值，調整DNA終濃度在30～50 ng/μL之間。 2）引物設計及引物稀釋：根據SNP位點通過美國Sequenom公司的Assay Design 3.1軟件進行引物設計；通過質譜預實驗進行延伸引物質檢，將引物稀釋到質譜反應所需濃度。PCR引物儲備液制備：配置PCR引物儲備液，終濃度為100 μmol/L；單堿基延伸引物儲備液制備：配置單堿基引物儲備液，終濃度為500 μmol/L；引物設計詳細（見表2）。

3） PCR反應：5μL的PCR反應體系中含有ddH20 1.8 μL，10* buffer 0.5μL，Mg2+ 0.4 μL，dNTP 0.1 μL，Hot star 0.2μL，F Primer/R Primer 1μL，基因組DNA樣品（20—50 ng），至終體積5μL。PCR擴增反應條件：95℃2 min預變性，95 0C 30 s，56 0C 30 s，72 0C 60 s*45個循環；72 0C 5 min；25 aC∞。

4） SAP酶消化反應：按照下述順序配制SAP酶Mix：總體積2x460，dddH20 1.53x460pLL，SAP Buffer 0.17x460 μL，SAP Enzyme 0.3x460μL，下一步在PCR儀中按照下述程序進行SAP酶消化：37 0C 40 min，85 0C 5 min，25 0C ∞。

5）單堿基延伸反應：按照下述順序配制單堿基延伸反應Mix：三蒸水0.619x460 μL，lOx iplex buffer 0.2x460 μL，Terminator mix 0.2x460μL.引物0.94x460 μL，單堿基延伸酶0.041x460 μL，至終體積2x460 μ1。下一步在PCR儀中按照下述程序進行單堿基延伸反應：預變性94℃30 s，分別為94 °C 5 s，52℃Ss進行40個外部循環，分別為80 °C 5 s，72 0C 3 min進行40個內部循環，25 °C ∞。

6）樹脂純化：將反應產物的384孔板中加入16 μL三蒸水，在離心機中離心2 000轉離心3 min；加入樹脂，在反轉搖勻儀上做樹脂純化反應35 min，脫鹽；反應完成后在離心機中離心2 000轉離心3 min。將脫鹽處理后的樣品點在樣品靶上，自然結晶。

7）進行質譜檢測，并收集數據：MALDI-TOF-MS（基質輔助激光解析電離飛行時間質譜）反應；Typer 4.0軟件檢測質譜峰，并根據質譜峰圖判讀各樣本目標位點基因型。1.4統計學處理

將所有完成的問卷統一編碼，使用SPSS Data Entry 2.0軟件建立數據庫。所選SNP位點群體基因型經Hardy-Weinberg平衡檢驗。采用直接計數法對各個SNP位點在新疆維吾爾族人群中的頻率分布進行統計。采用X2檢驗進行男女兩組之間的基因型及等位基因頻率分布特征的比較。

2 結果

1） SNP位點借于MAF值進行Hardy -Wein-berg遺傳平衡定律檢驗。

一般以P=0.05作為顯著性水平的界值，P>0.05說明所調查的群體達到遺傳平衡，即本次群體調查的數據可信；SNP分子標識的選擇依據：①最小等位基因頻率（MAF）≥0.05；②PPARG與多代謝異常有關的SNP；③所選的SNP位于基因片段功能區或可能改變功能的區域[19J。X2檢驗中自由度的法則為：由于總的理論數必須等于總的實際數（作為限制條件，必須從總的自由度中減1），需要估計的參數實際上只有等位基因頻率a，其余等位基因和全部基因型頻率都可以由其推算出，所以需要估計的參數數目為1，df=總的分類數（即基因型的數目）一1（需要估計的參數數目1。PPA RG基因所篩選的SNPs位點中除了rs4135329、rs4135356、rs4135354、rs6805419、rs -9870196、rs17036700、rs4135304、rs4135343位點以外，其他23個位點均符合Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性（P>0.05）（見表1）。

2）對新疆地區50例維吾爾族無關個體進行SNP分型檢測獲得31個SNP位點的基因型。

采用直接記數法計算，得到每個位點的最小等位基因頻率（MAF）。rs4135329、rs4135356、rs4135354、rs6805419、rs9870196、rs17036700位點第1個等位基因頻率為1，第2個等位基因頻率都為0。rs4135304、rs4135343位點第1個等位基因頻率為0，第2個等位基因頻率都為1（見表3）。

3）進一步對具有多態性的23個位點進行基因型頻率分布計算。

在23個SNP位點中，rs1899951、rs2292101、rs-2881654、rs1801282等位點的第一個純合體基因型頻率最高，頻值0.74，rs6782475、rs7626560等位點的第一個純合體基因型頻率最低，頻值均為0。在雜合體中rs17036242、rs7615916、rs9310401等位點的雜合體基因型頻率最高，頻值分別為0.60、0.63、0.60。rs6782475位點雜合體基因型頻率最低，頻值均為0.12。在第2個純合體中，rs3856806、rs6782475等位點的基因型頻率最高，頻值分別為0.68、0.88。rs17036242、rs1899951、rs-2292101、rs2881654、rs9310401、rs1801282等位點基因型頻率最低，頻值均為0—0.02（見表4）。

4）采用SPSS軟件X2檢驗進行男女兩組之間的基因型及等位基因頻率計算。

在rs2292101位點第2個純合體的基因型在男和女都為0，所以無法進行卡方檢驗，rs6782475、rs7626560位點第一個純合體的基因型在男和女都為0，所以無法進行卡方檢驗，其他位點的基因型和等位基因頻率在男女組間的差異均未達到統計學意義（P>0.05）（見表5）。

3討論

過氧化物酶體增殖物活化受體y（PPA R-y），也稱胰島素增敏劑受體，是一種位于人類染色體上的二型核受體，由PPARG基因編碼，對脂肪細胞和胰島素有重要的作用，是治療糖尿病的研究對象之一[16-22]。PPA R-y通過JAK -STAT、激活蛋白-1（AP-1）、NF-rd3、活化T細胞核因子信號通路（NFAT）來抑制炎癥反應；通過抑制泡沫細胞的分化、炎癥反應以及細胞增殖來抑制動脈粥樣硬化的發生發展；通過磷脂酰肌醇三激酶（P13K）、瘦素、脂鏈素等信號通路來參與糖穩態的調節；通過細胞周期的調控來影響腫瘤生長；參與脂肪細胞分化并與肥胖密切相關。明確這些相關信號通路以及相關細胞因子的作用，可對相關疾病機制及防治進一步提供有力依據和干預途徑[23]。

代謝綜合征是臨床上具有肥胖、高血壓、血脂紊亂、受損的糖耐量或糖尿病以及胰島素抵抗等一系列代謝失常癥狀的并稱，是多種代謝成分異常聚集的的病理狀態。引起上述代謝失常癥狀的因素有很多，包括胰島素抵抗、炎癥反應、脂肪組織分泌的各種細胞因子的參與、生活方式及遺傳因素等，但其根本原因還是能量代謝的失衡[24-26]。因此，代謝綜合征治療手段的探索和相關藥物的開發已成為國內外科學工作者關注的熱點。

本研究中，從新疆維吾爾族人群50例無關個體提取血液DNA，使用Haploview 4.1分析軟件，對過氧化物酶體增殖物激活受體（ PPARG）相關SNP位點篩選，為了避免由于SNP的MAF過低而產生的統計偏倚，首先考慮納入（最小等位基因）MAF>0.05的多態位點，并根據多人群研究情況選擇熱點多態性位點優先進入候選分型。結果顯示，篩選的31個位點中rs1151999、rs1175540、rs17036242、rs1875796、rs1899951、rs2292101、rs -2881654、rs2921190、rs2938397、rs2959272、rs295 -9273、rs2972162、rs3856806、rs4135247、rs4135275、rs4684846、rs6782475、rs709151、rs7615916、rs76 -26560、rs9310401、rs9817428、rs1801282等23個位點具有多態性。在男女組間23個SNP位點的基因型和等位基因頻率差異均沒達到統計學意義（P>0.05）。

目前，我們只是對以上SNP位點在新疆維吾爾族人群的多態性特征進行了調查，為進一步的群體遺傳學的研究和基因多態性普查奠定了基礎，并為今后進行疾病前瞻性研究提供了重要的基礎資料，但是，這些位點與過氧化物酶體增殖物激活受體的相關性如何，有待于進一步研究。

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