武漢地區黃瓜靶斑病病原鑒定及生物學特性研究

楊紹麗等

摘 要：2011年7月在武漢黃陂發現黃瓜靶斑病，對病樣進行分離、致病性測定、形態學鑒定，并對病原進行了生物學特性研究。結果表明，引起武漢地區黃瓜靶斑病的病原菌為多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）。這是多主棒孢霉在武漢引起黃瓜靶斑病的首次報道。生物學特性研究結果表明，光照有利于病原菌菌絲生長；病原菌菌絲生長的適宜溫度范圍為25～30℃；最適宜pH值為6～9；病原菌能夠利用多種碳源和氮源，碳源以麥芽糖利用效果最好，氮源以硝酸鉀利用效果最好。

關鍵詞：黃瓜；靶斑?。欢嘀靼翩呙?；生物學特性

黃瓜靶斑?。–orynespora cassiicola），又名黃瓜褐斑病，在我國遼寧[1，2]、河南、河北、山東、寧夏、甘肅、江蘇、上海、廣東等地黃瓜上發生嚴重[3～10]。2011年7月首次在武漢栽培黃瓜上發現有類似靶斑病的癥狀，2011-2014年武漢各露地蔬菜和設施蔬菜均發現有靶斑病為害。本研究在實驗室條件下對病原菌的形態特征、致病性以及生物學特性進行了初步研究，以明確武漢地區導致該病害發生的病原菌種類及該病原菌對不同理化環境和營養條件的需求，以期對其發生規律和防治措施進行有效探索。

1 材料與方法

1.1 病樣采集及癥狀觀察

2011-2014年在武漢黃陂、蔡甸等蔬菜基地黃瓜上發現有疑似靶斑病癥狀，觀察記錄癥狀并拍照。

1.2 病樣的分離

采用常規組織分離法[11]：取病斑典型的新鮮葉片，用無菌水沖洗干凈，切取病健交界處的組織，先用0.1%升汞消毒1～2 min，再用75%酒精消毒1 min左右，最后用無菌水沖洗3次，每次1 min。消毒完成后，吸干組織表面水分，再將可能被殺死的組織剪去，剪成小塊，每皿3～5塊，接在PDA平板上，置于25℃恒溫箱中培養。菌落形成后，選典型菌落轉接3次，進行純化，4℃保存備用。

1.3 致病性測定

采用孢子懸浮液噴霧接種法：將菌株在PDA上暗培養，待產孢后在培養皿中加無菌水，再用干凈玻片刮取孢子，4層紗布過濾制成孢子懸浮液，濃度為103～104個/mL。取生長良好、長出2片真葉的健康黃瓜苗，用上述孢子懸浮液噴霧接種到黃瓜葉片，接種后保濕24 h，觀察記錄發病情況，發病后再從發病部位取樣進行再分離，以確定是否為致病菌。

1.4 病原菌形態學鑒定

通過柯赫氏法則驗證，確定引起黃瓜靶斑病的病原。將供試菌株接種到PDA平板上，25℃培養箱暗培養，測量菌落生長直徑，描述菌落顏色、形態，挑取培養物，用顯微鏡觀察分生孢子器、分生孢子形態，測量其大小。

1.5 病原菌生物學特性

①光照對病原菌菌絲生長的影響 在活化培養7 d的菌落邊緣，打取直徑6 mm的菌餅，接種于PDA平板中央。將接菌后培養皿置于25℃ HP250GS智能型人工氣候培養箱恒溫培養。設置連續黑暗、12 h光暗交替、連續光照3個處理，每個處理3個重復，5 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

②不同溫度對病原菌菌絲生長的影響 在活化培養7 d的菌落邊緣，打取直徑6 mm的菌餅，接種于PDA平板中央，將接菌后的培養皿分別置于5、10、15、20、25、30、35、40℃恒溫箱中培養，每個處理3個重復，5 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

③不同 pH值對病原菌菌絲生長的影響 將PDA 培養基的 pH值分別調節為3.0，4.0，5.0，6.0， 7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，制成不同pH值的平板，在平板中央接種6 mm 的新鮮菌餅，3個重復，25℃恒溫暗培養，5 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

④不同碳、氮源對病原菌菌絲生長的影響 以查氏培養基[11]為基礎培養基。用含碳量相同的葡萄糖、麥芽糖、乳糖、木糖、果糖、可溶性淀粉代替其中的蔗糖。用含氮量相同的尿素、硝酸鈉、硝酸銨、氯化銨、精氨酸代替其中的硝酸鉀。在活化培養7 d的菌落邊緣，打取直徑為6 mm的菌餅，接種在不同碳、氮源平板中央，3個重復，置于25℃恒溫箱培養，5 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

2 結果與分析

2.1 黃瓜靶斑病田間癥狀及病原菌的分離培養

2011年7月在武漢黃陂武湖黃瓜展示田，發現黃瓜中下部葉片出現疑似靶斑病的癥狀。葉片發病初期為黃色水浸狀斑點、稍凹陷。發病中期病斑擴大為近圓形、圓形或不規則形，灰白色，在圓形或近圓形病斑中央常會有淡黃色的小斑點（圖1A）。中后期多個病斑常連成片。該病常與霜霉病、細菌性角斑病混合發生，易與細菌性角斑病混淆。

2011-2014年每年從發病嚴重的田塊，采集疑似靶斑病病樣標本，對8份樣品進行分離，均能分離出棒孢霉屬（Corynespora sp.）真菌且形態一致。以2011年分離菌株HPbb為典型菌株進行鑒定，本文中涉及到病原菌的所有試驗，使用的均為該菌株。

2.2 致病性測定

配制103～104個/mL的分生孢子懸浮液噴霧接種于20株2片真葉期黃瓜幼苗，結果表明，植株的發病率為100%。接種3 d后，零星有葉片出現水浸狀病斑，7 d后出現典型病斑，同田間發病癥狀（圖1A）一致，對照無癥狀（圖1B）。從發病葉片再次分離，獲得培養性狀和形態特征與接種菌一致的分離物。

2.3 病原菌形態學鑒定

分離物在PDA培養基上暗培養，菌落平、致密，呈輻射狀展開，邊緣規則，氣生菌絲絨毛狀，顏色為灰色、褐色至灰黑色，5 d后菌落平均直徑46.7 mm（圖2A）。菌絲淡褐色，有隔膜，分枝。分生孢子梗淡褐色、直或彎曲、不分枝、具隔膜，分生孢子梗有層出現象，大小多為（90～210）μm×（3～5）μm。分生孢子淺褐色，壁平滑，倒棍棒形，頂端鈍圓，直或彎曲，具有假隔膜2～9個，大小（20～195.5）μm×（5～10）μm（圖2B），孢子幼時單生或串生（圖2C）。

通過對PDA培養基上的培養形態、菌絲、分生孢子、分生孢子梗等形態的描述，這些特征與其他文獻[5，9，10，12～15]報道的關于黃瓜靶斑病多主棒孢菌的描述基本一致，確定引起武漢地區黃瓜靶斑病的病原為多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）。

2.4 病原菌生物學特性研究

①光照條件對病原菌菌絲生長的影響 由圖3可以看出，在連續黑暗、12 h光暗交替、連續光照3種條件下，病原菌在PDA平板上培養5 d后，連續光照條件下菌落平均直徑最大，達50.67 mm，說明光照對菌絲生長有促進作用。

②溫度對病原菌菌絲生長的影響 由圖4結果可以看出，不同溫度下生長5 d，病原菌菌落直徑差異顯著，說明溫度對病菌的生長影響很大。病原菌在10～35℃均能生長，菌絲生長最適溫度為25～30℃；30℃時，5 d菌落直徑最大，達51.0 mm；5℃以下及溫度達到40℃時，菌絲停止生長。

③pH值對病原菌菌絲生長的影響 由圖5可以看出，PDA平板上，病原菌菌絲在pH值3～12時均可生長，適宜生長的pH值為6～9；其中pH值為8時菌絲生長最快，5 d后菌落平均直徑51.83 mm。說明該菌最適合在中性偏堿條件下生長。

④碳、氮源對病原菌菌絲生長的影響 由表1可以看出，病原菌能夠利用多種碳源和氮源，其中以麥芽糖作碳源最有利于菌絲生長，5 d后菌落直徑達到47.17 mm，其次是乳糖，可溶性淀粉最差；以硝酸鉀作氮源最利于菌絲生長，5 d后菌落直徑達到39.83 mm，氯化銨利用效果最差。

3 討論與結論

經病原菌的分離培養、形態學鑒定以及致病性測定，引起武漢地區黃瓜靶斑病的病原為Corynespora cassiicola，為半知菌亞門多主棒孢霉，該病原形態與前人研究[3～5，9，14，15]描述的黃瓜靶斑?。ê职卟。┎≡螒B基本一致。對病原菌生物學特性研究表明，黃瓜靶斑病菌在10～35℃下均能生長，最適溫度為30℃，與前人研究[2，5，15，16]報道的基本一致；光照能促進菌絲生長，與劉鳴韜等[16]的報道一致；本研究中最適宜病原菌菌絲生長的pH值為6～9，與鄒慶道等[15]的研究結果基本一致，而李長松等[5]的研究結果中菌絲生長最適宜pH值為5～8，說明黃瓜靶斑病菌菌絲生長在不同地區對pH值的要求不同。本研究中病原菌能夠利用多種碳、氮源，碳源以麥芽糖和乳糖效果最好，與劉鳴韜等[16]研究結果基本一致；在氮源利用上，以硝酸鉀作氮源最有利于菌絲生長。以上研究結果表明，引起武漢地區黃瓜靶斑病的病原多主棒孢霉是一種耐高溫、最適宜中性弱堿環境生長并能夠利用多種碳氮源的病原真菌。本研究結果為今后了解多主棒孢霉的侵染和靶斑病病害流行奠定了基礎，對其他因子以及分生孢子的生物學特性有待進一步研究。

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