UPLC-MS／MS法測(cè)定3種獸藥制劑中違禁藥物氯丙嗪

李波平，花錦，李涵，陳谷峰，劉能盛，肖前，李丹，趙泉，單利君

（1.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣州510623；2.山西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，太原030024；3.暨南大學(xué)包裝工程研究所，廣東珠海519000）

UPLC-MS／MS法測(cè)定3種獸藥制劑中違禁藥物氯丙嗪

李波平1，花錦2，李涵1，陳谷峰1，劉能盛1，肖前1，李丹1，趙泉1，單利君3

（1.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣州510623；2.山西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，太原030024；3.暨南大學(xué)包裝工程研究所，廣東珠海519000）

建立了3種獸藥制劑中違禁藥物氯丙嗪的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS／MS）檢測(cè)方法。用無水乙醇超聲提取試樣中違禁藥物氯丙嗪，采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），乙腈和10 mmol／L乙酸銨+0.1%甲酸溶液流動(dòng)相，梯度洗脫，電離噴霧電離方式（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）定量。該方法線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2達(dá)到0.9956，回收率在88.3%～96.7%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）介于3.7%～8.1%。方法的檢出限為0.003 mg／kg。本方法適用于獸藥制劑中氯丙嗪違法添加的定性、定量分析。

獸藥制劑；氯丙嗪；違禁藥物；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

氯丙嗪是吩噻嗪類代表藥物，又名冬眠靈，是常見的安眠、鎮(zhèn)靜、催眠藥物，為中樞多巴胺受體的阻斷劑，作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，獸醫(yī)臨床上主要被用作鎮(zhèn)靜藥［1］。飼料中添加此類藥物可間接起到催肥作用；使用吩噻嗪類藥物可降低動(dòng)物運(yùn)輸過程中的死亡率［2］，因此一些不法分子受利益所趨經(jīng)常使用添加氯丙嗪的獸藥。殘留的藥物通過動(dòng)物食品進(jìn)入人體，并經(jīng)長(zhǎng)期蓄積后引起中毒，大劑量時(shí)可引起人體肝臟、腎臟的病變，甚至危害生命健康。為此，我國(guó)農(nóng)業(yè)部在176號(hào)和235號(hào)公告中明確禁止在動(dòng)物飼料中使用氯丙嗪，在動(dòng)物源食品中不得檢出［3-4］；農(nóng)業(yè)部第193號(hào)公告中，氯丙嗪被明確禁止在獸藥中使用。在進(jìn)出口貿(mào)易中，氯丙嗪已被列入禁用類藥物，國(guó)家規(guī)定不得檢出，日本肯定列表中也明確表示氯丙嗪不得檢出［5］。歐盟早已將氯丙嗪列入禁用清單中［6］。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于氯丙嗪檢測(cè)的研究涉及飼料［4］、豬肉［1，7］、豬肝［8-9］等動(dòng)物性食品［3，6］、血液［10］、蛋白［11］、血漿和生物組織［12-14］、尿液［15］等，以生物體內(nèi)殘留檢測(cè)為主。關(guān)于氯丙嗪的檢測(cè)方法，有氣質(zhì)聯(lián)用［1，9］、液相色譜［7，11，13］、液質(zhì)聯(lián)用［4，6，10］、化學(xué)發(fā)光［16］等，國(guó)內(nèi)外尚未有測(cè)定獸藥制劑中氯丙嗪的文獻(xiàn)報(bào)道。GC和GC-MS對(duì)藥物的分析需要進(jìn)行衍生化，耗時(shí)較長(zhǎng)。LC-MS／MS靈敏度高，選擇性和特異性好［4］，在檢測(cè)領(lǐng)域得到越來越廣泛的應(yīng)用。本研究采用乙醇超聲提取，建立了UPLC-MS／MS法測(cè)定獸藥制劑中違禁藥物氯丙嗪。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備 ACQUITY Ultra Performance LCTM超高效液相色譜儀（美國(guó)，Waters公司），Premier串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)，Waters公司），HA-180M型電子天平，0.0001 g（日本A＆D公司）；移液器（德國(guó)Eppendorf股份公司）：0.2～0.5 mL，1～5 mL，10～100 mL，100～1000 mL；離心機(jī)HC-3518（杭州華創(chuàng)科學(xué)器材有限公司），渦旋混合器TALBOYS Advanced Vortex Mixer（杭州華創(chuàng)科學(xué)器材有限公司），超聲波KQ-500DB型（昆山超聲儀器有限公司），Mili-Q凈化水系統(tǒng)（法國(guó)進(jìn)口），濾膜：0.22 μm（美國(guó)Waters公司）。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 對(duì)照品 氯丙嗪標(biāo)準(zhǔn)品，純度99%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2.2 供試品

1.2.2.1 陰性對(duì)照獸藥制劑 喹氟寧（粉末）、替米考星（液體）、心肝包治（恩諾沙星可溶性粉），市售，以上三種獸藥制劑經(jīng)檢測(cè)均不含氯丙嗪。

1.2.2.2 陽性添加獸藥制劑 分別按0.01、0.02、0.1 mg／kg的比例在陰性對(duì)照獸藥制劑中添加氯丙嗪標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，混勻。

1.2.2.3 試劑 色譜純乙腈（美國(guó)，F(xiàn)isher公司），無水乙醇（分析純），超純水。

1.2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取氯丙嗪標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用乙腈溶解并準(zhǔn)確定容到10 mL，配制成濃度為1000 mg／L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。該溶液可在0～4℃冰箱中保存12個(gè)月。使用時(shí)稀釋成所需濃度。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 質(zhì)譜分析條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈／10 mmol／L乙酸銨+0.1%甲酸，梯度洗脫；柱溫35℃；流速0.3 mL／min；進(jìn)樣量10 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序表

質(zhì)譜條件如下。電離方式：電噴霧電離（ESI）；掃描方式：正離子掃描；離子源溫度120℃；脫溶劑氣溫度380℃；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；錐孔氣流：氮?dú)猓魉?0 L／h；去溶劑氣流：氮?dú)猓魉?00 L／h；碰撞氣：氬氣，碰撞氣壓3.5×10-3mbar；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。監(jiān)測(cè)條件參見表2。

表2 離子對(duì)、錐孔電壓、碰撞能量表

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈稀釋為0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 mg／L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，用1.3.1項(xiàng)的質(zhì)譜條件分析，記錄色譜圖。

1.3.3 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取（2±0.05）g固體或液體樣品，置10 mL具塞錐形瓶中，精密移取4 mL無水乙醇搖勻，2800 r／min渦旋3 min，100 W功率下超聲提取10 min，靜置，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，收集約1 mL至進(jìn)樣瓶，進(jìn)行UPLC-MS／MS分析。

1.3.4 樣品回收率與精密度 準(zhǔn)確稱取2.0 g喹氟寧（粉末）、替米考星（液體）、心肝包治（恩諾沙星可溶性粉）于10 mL錐形瓶中，分別添加濃度為0.5 mg／L的氯丙嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液0.04、0.08、0.4 mL至樣品中，制得添加水平分別為0.01（LOQ）、0.02（2LOQ）、0.1（10LOQ）mg／kg的樣品。按照本方法確定的條件進(jìn)行加標(biāo)回收重復(fù)性試驗(yàn)，每個(gè)濃度測(cè)定6次，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.5 檢測(cè)限和定量限 取空白樣品，按上述步驟操作，測(cè)得噪音信號(hào)的平均值，按信噪比（S／N≥3）測(cè)得方法的檢出限（LOD），按信噪比（S／N）≥10測(cè)得方法的定量限（LOQ）。

2 結(jié)果

2.1 色譜圖 采用1.3項(xiàng)的方法測(cè)定，待測(cè)物質(zhì)出峰時(shí)間為3.11 min，出峰時(shí)間短，峰形良好。三種獸藥制劑均未檢出氯丙嗪。在此僅以喹氟寧為例列圖說明。氯丙嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液、獸藥制劑喹氟寧空白樣品、獸藥制劑喹氟寧添加氯丙嗪（0.02 mg／kg）樣品的色譜圖分別見圖1、圖2、圖3。

圖1 氯丙嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.05 mg／L）MRM圖

圖2 獸藥制劑喹氟寧空白樣品MRM圖

圖3 獸藥制劑喹氟寧中添加氯丙嗪（0.02 mg／kg）MRM圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 用1.3.1項(xiàng)條件測(cè)定1.3.2標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，以峰面積為Y軸，對(duì)相應(yīng)的濃度（mg／L）為X軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程為：Y＝30353X-162.96，相關(guān)系數(shù)r2＝0.9956，線性關(guān)系良好。

2.3 方法的回收率與精密度 按照本方法的條件進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度水平進(jìn)行6次重復(fù)測(cè)定，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。結(jié)果表明，三種獸藥制劑的添加平均回收率在88.3%～96.7%之間，RSD介于3.7%～8.1%。

2.4 檢出限 通過空白樣品加標(biāo)的方法測(cè)定，方法的檢出限（LOD）為0.003 mg／kg，方法的定量限（LOQ）為0.01 mg／kg。

表3 氯丙嗪在獸藥制劑中的加標(biāo)回收率及變異系數(shù)表

3 討論與小結(jié)

3.1 提取溶劑的選擇 根據(jù)獸藥典（2000版），氯丙嗪易溶于水、乙醇和氯仿，不溶于乙醚和苯。本文考慮氯仿的毒性較大，且與反相液相色譜流動(dòng)相的兼容性較差，故排除氯仿。本研究以加標(biāo)回收率為指標(biāo)分別比較了水、乙醇、水∶乙醇（1∶1）的提取效果，對(duì)添加氯丙嗪濃度為0.01 mg／kg的空白心肝包治進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，當(dāng)使用乙醇作為提取劑時(shí)目標(biāo)物回收率最高，因此選用乙醇作為提取溶劑。

3.2 色譜柱及流動(dòng)相的選擇 根據(jù)文獻(xiàn)［4，10］及實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件，選用Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱，試驗(yàn)結(jié)果表明，采用該柱出峰時(shí)間短，與雜峰分離較好。文獻(xiàn)［4］提出流動(dòng)相中加入0.1%甲酸，可降低流動(dòng)相的pH值，有助于化合物的離子化，可以提高靈敏度。文獻(xiàn)［6］提出在流動(dòng)相中加入一定比例的銨鹽，可以使藥物易于出峰，改善峰形。乙酸銨是理想的流動(dòng)相，可有效抑制拖尾，增強(qiáng)電離作用。乙腈和甲醇是液相色譜質(zhì)譜常用的流動(dòng)相。綜合以上所述，本研究比較了乙腈／10 mmol／L乙酸銨+0.1%甲酸、乙腈／10 mmol／L乙酸銨、乙腈／0.1%甲酸、甲醇／10 mmol／L乙酸銨+0.1%甲酸、甲醇／10 mmol／L乙酸銨、甲醇／0.1%甲酸作為流動(dòng)相的分離效果。結(jié)果表明，選用乙腈／10 mmol／L乙酸銨+0.1%甲酸為流動(dòng)相，目標(biāo)化合物的響應(yīng)較高，離子化效果好，最終選用乙腈／10 mmol／L乙酸銨+0.1%甲酸為流動(dòng)相。

3.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 根據(jù)氯丙嗪物質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征，并參考文獻(xiàn)［2-3，10］選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式（MRM）、電噴霧離子源（ESI）進(jìn)行采集，在正離子掃描模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析，可觀察到氯丙嗪的［M+H］+分子離子峰，確定氯丙嗪的準(zhǔn)分子離子［M+H］+m／z為319.40。在對(duì)準(zhǔn)分子離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描時(shí)，又得到穩(wěn)定的碎片離子。進(jìn)一步對(duì)質(zhì)譜參數(shù)錐孔電壓和碰撞電壓進(jìn)行優(yōu)化，最終確定表2中的質(zhì)譜條件。

本方法為超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜-電噴霧正離子測(cè)定3種獸藥制劑中氯丙嗪，該方法操作簡(jiǎn)單、分析時(shí)間短、回收率高，填補(bǔ)了獸藥制劑中氯丙嗪檢測(cè)的空白，為檢測(cè)獸藥制劑中非法添加氯丙嗪提供了有效的技術(shù)支持。

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（編輯：侯向輝）

Determination of Chlorpromazine Illegally Added in 3 Kinds of Veterinary Preparations by UPLC-MS／MS

LI Bo-ping1，HUA Jin2，LI Han1，CHEN Gu-feng1，LIU Neng-sheng1，XIAO Qian1，LI Dan1，ZHAO Quan1，SHAN Li-jun3
（1.Guangdong Exit／Entry Inspection and Quarantine Bureau，Guangzhou 510623，China；2.Shanxi Exit／Entry Inspection and Quarantine Bureau，Taiyuan 030024，China；3.Packaging Engineering Institute of Jinan University，Guangdong，Zhuhai 519000，China）

A method of determination of chlorpromazine illegally added in 3 kinds of veterinary preparations by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS／MS）was developed.Chlorpromazine was extracted with ethanol by ultrasonic wave and separated on the Waters ACQUITY UPLC BEH C18 column（50 mm×2.1 mm，1.7μm）using the mobile phase of acetonitrile／mixture of 10 mmol／L ammonium acetate and 0.1%formic acid with gradient elution.Chlorpromazine was detected in electrospray ionization（ESI+）mode using multiple reaction monitoring（MRM）.There was a good linear relationship with the correlation rate more than 0.9956.The average recoveries ranged from 88.3%to 96.7%.The standard deviation was between 3.7%and 8.1%.The limit of detection was 0.003 mg／kg.The method was rapid，simple，sensitive and accurate.It was suitable for qualitative and quantitative analysis of the illicit drug chlorpromazine in veterinary preparations.

veterinary preparations；chlorpromazine；illicit drug；ultra-performance liquid chromatographytandem mass spectrometry（UPLC-MS／MS）

2015-02-10

A

1002-1280（2015）05-0032-05

S859.83

質(zhì)檢行業(yè)公益性科研專項(xiàng)（201010073-03）

李波平，碩士，工程師，從事進(jìn)出口商品檢測(cè)研究。E-mail：lbphappy＠163.com