梓醇抑制AGEs誘導的EA.hy926細胞炎癥反應及RAGE表達*

劉江月(濰坊醫學院病理生理教研室，山東濰坊261053)

梓醇抑制AGEs誘導的EA.hy926細胞炎癥反應及RAGE表達*

劉江月△
(濰坊醫學院病理生理教研室，山東濰坊261053)

［摘要］目的:研究梓醇對晚期糖基化終產物(AGEs)誘導的EA.hy926內皮細胞炎癥反應的抑制作用并探討其可能機制。方法:將常規培養的EA.hy926細胞隨機分為對照組、梓醇對照組、AGEs組以及梓醇高劑量(0.5 mmol/L)、中劑量(0.25 mmol/L)和低劑量(0.05 mmol/L)保護組。激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內活性氧簇(ROS)的生成; RT-PCR和Western blot檢測細胞中單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、血管細胞黏附分子1(VCAM-1)及晚期糖基化終產物受體(RAGE)的mRNA及蛋白的表達。結果:梓醇保護組ROS生成均明顯減少，MCP-1、TNF-α和VCAM-1的mRNA及蛋白表達均顯著降低，RAGE蛋白表達明顯受抑制，且呈劑量依賴性(P＜0.05)。結論:梓醇能夠有效抑制AGEs誘導的EA.hy926細胞內氧化應激，減輕炎癥反應，其機制可能與其降低RAGE表達有關。

［關鍵詞］梓醇;氧化應激;炎癥反應;晚期糖基化終產物受體

糖尿病大血管病變是是糖尿病相關心腦血管疾病的基礎，基本病理改變是動脈粥樣硬化。晚期糖基化終產物(advanced glycation end products，AGEs)是蛋白質、脂類的氨基與糖的醛基之間發生非酶性糖化氧化反應的終產物，與糖尿病大血管病變的發生發展密切相關。研究已經證實AGEs最主要的致病機制是與晚期糖基化終產物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)相互作用所介導的，AGEs能明顯增強內皮細胞中血管細胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)及細胞間黏附分子1 (intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)的表達，抗RAGE抗體及sRAGE阻斷RAGE能明顯抑制這些黏附分子表達［1-2］。同時有研究顯示在AGEs-RAGE相互作用誘導的糖尿病血管病變中，大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的誘導生成是關鍵步驟［3-4］。梓醇是從地黃塊根中提取的小分子環烯醚萜類化合物［5］，具有多種藥理學作用如降血糖、抗腫瘤、保護神經［6-8］等。我們在前期研究中發現，梓醇能夠抑制ROS生成減輕糖尿病大血管損傷［9］。本研究通過觀察梓醇是否能抑制RAGE的生成，降低AGEs-RAGE相互作用誘導的內皮細胞ROS產生，進而是否減輕炎癥反應的發生。

材料和方法

1材料

1.1細胞株與藥物人臍靜脈內皮細胞株EA.hy926購自上海拜力生物科技有限公司;梓醇標準品(純度≥98%)購于上海銘睿科技有限公司。

1.2主要試劑AGEs(Merk) ; DMEM低糖培養基(Gibco) ;胎牛血清(HyClone) ;胰蛋白酶(Sigma) ; 2'，7'-二氯熒光素雙乙酸鹽(DCFH-DA)試劑盒、Western blot相關試劑及MCP-1、TNF-α、VCAM-1、RAGE RT-PCR試劑盒(碧云天生物技術研究所) ; MCP-1、TNF-α、VCAM-1和RAGE I抗(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3主要儀器752型紫外分光光度計(上海精密儀器有限公司) ; DYCZ-25D型電泳儀(北京市六一儀器廠) ; Bio-Rad型濕轉儀(Bio-Rad) ;激光共聚焦顯微鏡(Olympus)。

2方法

2.1激光共聚焦顯微鏡觀察EA.hy926細胞ROS的生成生長良好的EA.hy926細胞接種于6孔板，實驗分為對照組(A組)、梓醇組(B組，0.5 mmol/L)、AGEs組(C組，200 mg/L)以及高劑量(D組，0.5 mmol/L)、中劑量(E組，0.25 mmol/L)和低劑量(F組，0.05 mmol/L)梓醇保護組。除A組外，其余各組先加入不同濃度梓醇孵育4 h后，C、D、E、F組分別再加入終濃度200 mg/L的AGEs培養30 min，棄培養液，用PBS洗3次，用無血清培養基按1∶1 000稀釋DCFH-DA，按照細胞培養液量的一半加入細胞，37℃孵育30 min。無血清培養液洗滌細胞3次后，488 nm激光激發，激光共聚焦顯微鏡直接觀察。

2.2 RT-PCR檢測梓醇對AGEs誘導EA.hy926細胞MCP-1、TNF-α、VCAM-1和RAGE的mRNA表達

將生長良好的EA.hy926細胞接種于6孔板，除A組外，其余各組先加入不同濃度梓醇孵育24 h后，C、D、E、F組分別再加入終濃度200 mg/L的AGEs培養24 h，收集細胞，按說明書操作提取總RNA，合成cDNA，2 μL的cDNA為模板，GAPDH為內參照，進行PCR擴增，引物設計見表1。

表1　引物序列Table 1.The sequences of the primers

2.3Western blot檢測梓醇對AGEs誘導EA.hy926細胞MCP-1、TNF-α、VCAM-1和RAGE蛋白的表達

將生長良好的EA.hy926細胞接種于6孔板，除A組外，其余各組先加入不同濃度梓醇孵育24 h后，C、D、E、F組分別再加入終濃度200 mg/L的AGEs培養24 h，收集細胞，提取總蛋白，SDS-PAGE電泳后切取目的條帶進行轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后加I抗(1∶500)，4℃過夜，TBST漂洗3次，加入II抗孵育1 h，化學發光反應，顯影定影，圖像分析。

3統計學處理

應用SPSS 18.0統計軟件進行統計學分析。實驗數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析比較組間差異，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1梓醇對AGEs誘導EA.hy926細胞ROS生成的影響

與A組比較，B組的ROS生成無明顯變化，C組的ROS生成顯著增加(P＜0.05) ;與C組比較D、E、F各組的ROS均明顯降低(P＜0.05)，與E組比較，D組的ROS生成明顯減少(P＜0.05)，而F組的ROS生成明顯增多(P＜0.05)，說明梓醇對EA.hy926細胞ROS的生成無影響，對AGEs誘導的EA. hy926細胞生成ROS呈明顯劑量依賴性抑制作用，見圖1。

Figure 1.The effect of catalpol on ROS production in AGEs-induced EA.hy926 cells.A: control group; B: catalpol group; C: AGEs group; D: high-dose catalpol+ AGEs group; E: middle-dose catalpol+ AGEs group; F: low-dose catalpol+ AGEs group.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs A group;#P＜0.05 vs B group;△P＜0.05 vs E group.圖1梓醇對AGEs誘導EA.hy926細胞內ROS生成的影響

2梓醇對AGEs誘導EA.hy926細胞MCP-1、TNF-α和VCAM-1 mRNA表達的影響

與A組比較，B組的MCP-1、TNF-α和VCAM-1 的mRNA表達均無明顯變化(P＜0.05)，C組的MCP-1、TNF-α和VCAM-1的mRNA表達均顯著增高;與C組比較，D、E、F各組的MCP-1、TNF-α和VCAM-1的mRNA表達均明顯減少(P＜0.05) ;與E組比較，D組的MCP-1、TNF-α和VCAM-1的mRNA表達明顯降低(P＜0.05)而F組的MCP-1、TNF-α和VCAM-1的mRNA表達明顯升高(P＜0.05)，說明梓醇對AGEs誘導EA.hy926細胞的MCP-1、TNF-α和VCAM-1的mRNA表達的影響呈明顯劑量依賴性，見圖2。

3梓醇對AGEs誘導EA.hy926細胞MCP-1、TNF-α和VCAM-1蛋白表達的影響

與A組比較，B組的MCP-1、TNF-α和VCAM-1的蛋白表達均無明顯變化(P＜0.05)，C組的MCP-1、TNF-α和VCAM-1的蛋白表達均顯著升高;與C組比較，D、E、F各組的MCP-1、TNF-α和VCAM-1的蛋白表達均明顯減少(P＜0.05) ;與E組比較，D組的MCP-1、TNF-α和VCAM-1的蛋白表達明顯降低(P＜0.05)而F組的MCP-1、TNF-α和VCAM-1的蛋白表達明顯升高(P＜0.05)，說明梓醇對AGEs誘導EA.hy926細胞的MCP-1、TNF-α和VCAM-1蛋白表達的影響呈明顯劑量依賴性，見圖3。

Figure 2.The effect of catalpol on the mRNA expression of MCP-1，TNF-α and VCAM-1 in AGEs-induced EA.hy926 cells.A: control group; B: catalpol group; C: AGEs group; D: high-dose catalpol+ AGEs group; E: middle-dose catalpol+ AGEs group; F: low-dose catalpol+ AGEs group.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs A group;#P＜0.05 vs B group;△P＜0.05 vs E group.圖2梓醇對AGEs誘導EA.hy926細胞MCP-1、TNF-α和VCAM-1 mRNA表達的影響

4梓醇對AGEs誘導EA.hy926細胞RAGE的mRNA及蛋白表達的影響

與A組比較，B組RAGE的mRNA及蛋白表達無明顯變化，C組RAGE的mRNA及蛋白表達均明顯上調(P＜0.05) ;與C組比較，D、E、F組RAGE的mRNA及蛋白表達均明顯受抑制(P＜0.05) ;與E組比較，D組RAGE的mRNA及蛋白表達明顯受抑制(P＜0.05)而F組RAGE的mRNA及蛋白表達明顯上調(P＜0.05)，說明梓醇對AGEs誘導EA.hy926細胞RAGE的mRNA及蛋白表達的影響呈明顯劑量依賴性，見圖4、5。

討論

AGEs在糖尿病中研究較多，體內AGEs慢性蓄積與動脈粥樣硬化之間有明顯因果關系，是糖尿病血管病變的觸發因素［10-12］。RAGE是存在于內皮細胞表面的AGEs特異性受體，它與AGEs的結合可引起內皮細胞多種功能障礙，是引起糖尿病血管疾病的重要因素［13］。AGEs與RAGE結合誘導細胞內氧化應激和ROS產生增加，本研究也發現AGEs誘導的EA.hy926細胞RAGE表達明顯升高同時細胞內ROS大量產生。Choi等［14］研究發現梓醇能夠抑制AGEs誘導的THP-1細胞ROS的大量生成;楊清俊等［15］研究也發現梓醇能夠抑制高糖誘導的氧化應激。本研究采用不同濃度梓醇進行干預，結果也發現梓醇呈劑量依賴性抑制AGEs誘導的EA.hy926細胞內ROS的產生，這與我們的前期結果及前人的研究是一致的［9］。Choi等［14］研究表明梓醇明顯抑制RAGE表達，本研究結果也發現梓醇呈劑量依賴性抑制RAGE的表達，說明梓醇可能是通過抑制RAGE表達，阻斷了AGEs-RAGE的相互作用，從而抑制了細胞內ROS的大量生成，抑制氧化應激。

Figure 3.The effect of catalpol on the protein expression of MCP-1，TNF-α and VCAM-1 in AGEs-induced EA.hy926 cells.A: control group; B: catalpol control group; C: AGEs group; D: high-dose catalpol+ AGEs group; E: middle-dose catalpol+ AGEs group; F: low-dose catalpol+ AGEs group.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs A group;#P＜0.05 vs B group;△P＜0.05 vs E group.圖3梓醇對AGEs誘導EA.hy926細胞MCP-1、TNF-α和VCAM-1蛋白表達的影響

Figure 4.The effect of catalpol on the mRNA expression of RAGE in AGEs-induced EA.hy926 cells.A: control group; B: catalpol control group; C: AGEs group; D: high-dose catalpol+ AGEs group; E: middle-dose catalpol+ AGEs group; F: low-dose catalpol+ AGEs group.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs A group;#P＜0.05 vs B group;△P＜0.05 vs E group.圖4梓醇對AGEs誘導EA.hy926細胞RAGE mRNA表達的影響

Figure 5.The effect of catalpol on the protein expression of RAGE in AGEs-induced EA.hy926 cells.A: control group; B: catalpol control group; C: AGEs group; D: high-dose catalpol+ AGEs group; E: middle-dose catalpol+ AGEs group; F: low-dose catalpol+ AGEs group.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs A group;#P＜0.05 vs B group;△P＜0.05 vs E group.圖5梓醇對AGEs誘導EA.hy926細胞RAGE蛋白表達的影響

AGEs-RAGE的相互作用能誘導細胞內氧化應激，ROS產生增強，產生的ROS反過來又激活多種信號轉導通路，通過級聯放大反應，進一步調節多種基因的轉錄表達，其中大多數是與炎癥、免疫及動脈粥樣硬化相關的，如細胞因子(IL-6、TNF-α)、生長因子(TGF-β、VEGF、IGF、PDGF)、黏附分子(VCAM-1、ICAM-1)和組織因子(tissue factor，TF)，促進糖尿病血管病變的發生和發展［16］。多項研究發現［14，17］梓醇能抑制多種細胞炎癥因子的釋放，本研究發現梓醇劑量依賴性地抑制AGEs誘導的EA.hy926細胞MCP-1、TNF-α和VCAM-1的mRNA和蛋白的表達。因此，我們推測梓醇抑制AGEs誘導的EA.hy926細胞炎癥反應，其機制可能與其抑制AGEs誘導的EA.hy926細胞RAGE表達，阻斷AGEs-RAGE相互作用，抑制氧化應激反應有關。

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(責任編輯:林白霜，羅森)

Inhibitory effect of catalpol on inflammation and expression of RAGE in EA.hy926 cells induced by advanced glycation end products

LIU Jiang-yue
(Department of Pathophysiology，Weifang Medical College，Weifang 261053，China.E-mail: jiangyue7879@126.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the inhibitory effect of catalpol on inflammation in EA.hy926 cells induced by advanced glycation end products (AGEs) and to explore its antioxidant mechanisms.METHODS: Human endothelial cell line EA.hy926 was cultured and randomly divided into control group，catalpol (0.5 mmol/L) group，AGEs group，highdose (0.5 mmol/L) catalpol+ AGEs group，middle-dose (0.25 mmol/L) catalpol+ AGEs group and low-dose (0.05 mmol/L) catalpol+ AGEs group.Intracellular reative oxygen species (ROS) production was detected by laser scanning confocal microscopy.The levels of monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1)，tumor necrosis factor-α(TNF-α) and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) in culture supernatant were detected by commercial ELISA kits.The expression of MCP-1，TNF-α，VCAM-1 and receptor for advanced glycation end products (RAGE) in the EA.hy926 cells were detected by Western blot.RESULTS: In high-dose catalpol+ AGEs and middle-dose catalpol+ AGEs groups，the generation of ROS was decreased significantly.The levels of MCP-1，TNF-α and VCAM-1，and protein expression of MCP-1，TNF-α and VCAM-1 were significantly lower.The expression of RAGE protein in EA.hy926 cells were significantly inhibited (P ＜0.05).CONCLUSION: Catalpol effectively inhibits the AGEs-induced oxidative stress and inflammation in EA.hy926 cells，which may be associated with a decrease in the expression of RAGE.

［KEY WORDS］Catalpol; Oxidative stress; Inflammation; Receptor for advanced glycation end products

通訊作者△Tel: 0536-8462020; E-mail: jiangyue7879@126.com

*［基金項目］國家自然科學基金資助項目(No.8130068) ;山東省自然科學基金資助項目(No.ZR2009CQ013) ;山東省中醫藥管理局資助項目(No.2013-237)

［收稿日期］2015-02-02［修回日期］2015-03-17

［文章編號］1000-4718(2015)09-1693-06

［中圖分類號］R543.1; R363

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.029