陜西平利地區絞股藍黃酮類成分HPLC指紋圖譜研究

彭 亮,李詒光,2*,陳 杰*,饒 毅,季巧遇,魏惠珍

(1.江西中醫藥大學,江西 南昌 330006；2.江中藥業股份有限公司,江西 南昌330096)

?

陜西平利地區絞股藍黃酮類成分HPLC指紋圖譜研究

彭 亮1,李詒光1,2*,陳 杰1*,饒 毅1,季巧遇1,魏惠珍1

(1.江西中醫藥大學,江西 南昌 330006；2.江中藥業股份有限公司,江西 南昌330096)

目的：建立陜西平利地區絞股藍黃酮類成分的HPLC指紋圖譜。方法：采用反向高效液相色譜法，色譜柱為ZORBAX SB-C18色譜柱(150mm×4.6mm，5μm)；以乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)為流動相進行梯度洗脫；柱溫：30℃；檢測波長：360nm；流速：1.0mL/min；進樣量：10μL。結果：10批絞股藍黃酮類成分HPLC指紋圖譜中共標定了26個共有指紋特征峰，其中2個色譜峰確定為蘆丁和槲皮素，且10批藥材的相似度均達到0.98以上。結論：該方法穩定、可靠，精密度高，重復性好，可為絞股藍藥材的質量控制提供依據。

絞股藍；陜西平利；黃酮類成分；HPLC；指紋圖譜

絞股藍為葫蘆科絞股藍屬多年生草本植物Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino.的根莖或全草[1-3]，又名七葉膽、天堂草、遍地生根等。該屬植物基源復雜、品種繁多，全世界約有16種和3變種，我國有14種和3變種[4]，廣泛分布于陜西、湖北、安徽、福建、云南、廣西等地。其味苦微甘，性涼；歸肺、脾、腎經，具有清熱解毒、化痰止咳、益氣健脾、養陰生津、養心安神等功效[5]。現代研究表明，黃酮類成分是絞股藍的主要化學成分，具有抗氧化、清除自由基、抗癌防癌、改善心腦血管循環和調節血壓等作用[6-8]。絞股藍作為一種與人參相似的免疫增強劑，有“南方人參”的美譽，民間稱其為神奇的“不老長壽藥草”，在保健食品和新型藥品研發上都有巨大的應用前景，是一種新的藥食兩用植物資源[9-12]。目前，關于陜西平利地區絞股藍藥材黃酮類成分指紋圖譜研究未見文獻報道，為進一步評價該地區絞股藍藥材質量，本研究建立了陜西平利產地絞股藍黃酮類成分的HPLC指紋圖譜，并對10批絞股藍黃酮類成分的HPLC指紋圖譜進行評價分析，以便能更加全面地反映該地區絞股藍藥材的質量現狀，為絞股藍藥材的質量控制和道地藥材GAP實施提供參考依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)，包括 G1379A 在線真空脫氣機、G1311A 四元泵、G1367A 自動進樣器、G1316A 柱溫箱和 G1315B DAD檢測器；SK5200LH超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)；AB204-N型精密分析天平(METTLER TOLEDO上海衡器有限公司)；HH-4數顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)。

1.2 試藥

絞股藍藥材經鑒定為葫蘆科絞股藍屬多年生草本植物Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino的根莖或全草，藥材來源見表1。蘆丁對照品(批號為100080-200707，中國食品藥品檢定研究院)，槲皮素對照品(批號為100081-200907，中國食品藥品檢定研究院)。甲醇、乙腈為色譜純；水為娃哈哈飲用純凈水；其它試劑均為分析純。

表1 絞股藍藥材樣品來源

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備

取蘆丁、槲皮素對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解制成含蘆丁253.5μg·mL-1、槲皮素3.62μg·mL-1的對照品溶液。

2.2 供試品溶液制備

取絞股藍藥材干燥粉末(過四號篩)約1.0g，精密稱定，置索氏提取器中，加石油醚(60～90℃)適量，加熱回流至提取液無色，放冷，棄去石油醚液，藥渣連同濾紙揮干溶劑，移入具塞錐形瓶中，加入70%甲醇溶液50mL，稱定重量，回流提取1.0h，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，過濾，濾液蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉移至25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.3 色譜條件

ZORBAX SB-C18色譜柱 (150mm×4.6mm，5μm)；以乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)為流動相進行梯度洗脫，梯度洗脫條件見表2。柱溫：30℃；檢測波長：360nm；流速：1.0mL/min；進樣量：10μL。

2.4 測定方法

分別吸取對照品溶液與供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，按“2.3”項下色譜條件測定，記錄55min色譜圖。供試品色譜圖中，以蘆丁峰作為參照峰(s)，指定其相對保留時間和相對峰面積為1，計算其它特征指紋峰的相對保留時間和相對峰面積的比值。

表2 梯度洗脫條件

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度考察 取同一份絞股藍供試品溶液，按“2.3”項所述色譜條件連續進樣6次，并記錄色譜圖。選取蘆丁色譜峰作為參照峰，計算其他特征峰對其的相對保留時間和相對峰面積。結果各特征峰的相對保留時間RSD值小于0.33%，相對峰面積RSD值小于4.77%。結果表明，該方法精密度良好。

2.5.2 穩定性考察 取絞股藍藥材干燥粉末(批號：2014.02.19，過四號篩)，按“2.2”項下制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件在0、2、4、8、12、24h依次進樣，記錄不同時間的色譜圖，計算各特征峰相對于蘆丁峰的相對保留時間值和相對峰面積值。結果各特征峰的相對保留時間RSD值小于0.15%，相對峰面積RSD值小于4.98%。結果表明，樣品在24h內穩定性良好。

2.5.3 重復性考察 取同一批絞股藍藥材干燥粉末(批號：2014.02.19，過四號篩)6份，按“2.2”項下制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件分別進樣測定，記錄色譜圖。計算各特征峰相對于蘆丁峰的相對保留時間值和相對峰面積值。結果各特征峰的相對保留時間RSD值小于0.29%，相對峰面積RSD值小于4.86%。結果表明，所建立的指紋圖譜方法能夠實現較好的重復性。

2.6 指紋圖譜及技術參數

2.6.1 絞股藍黃酮類成分指紋圖譜建立 按“2.2”項下供試品溶液制備方法和“2.3”項下色譜條件分析陜西平利地區的10批絞股藍藥材，得到10批絞股藍黃酮類成分HPLC指紋圖譜，見圖1。55 min內有26個特征指紋峰是10批絞股藍藥材所共有，每張指紋圖譜中所選共有峰的峰面積總和大于總峰面積的90%。

2.6.2 特征指紋峰的標定 根據相對保留時間標定特征指紋峰，對10批絞股藍HPLC-FPS測定結果進行比較分析，發現26個特征峰是10批絞股藍所共有，因此確定這26個峰為特征指紋峰。其中，通過對照品HPLC圖譜確定1號峰為蘆丁，14號峰為槲皮素，見圖2。以1號峰(蘆丁)為參照峰，計算其他特征峰相對于1號峰的相對保留時間和相對峰面積，見表3、表4。

圖1 陜西平利地區10批絞股藍黃酮類成分對照指紋圖譜

圖2 絞股藍黃酮類成分HPLC指紋圖譜

2.7 相似度評價

采用國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統 (2004A版)”，對10批絞股藍藥材進行相似度評價分析，以中位數生成參照譜，時間窗寬度為0.02。結果表明：10批絞股藍藥材指紋圖譜相對參照譜的相似度結果分別為0.995、0.998、0.995、0.997、0.991、0.988、0.994、0.984、0.995、0.993。由相似度結果可知，10批藥材的指紋圖譜與對照譜相比較，其相似度均達到0.98以上，表明藥材質量穩定，差異較小。

3 討論

采用HPLC-UV檢測分析發現，在360nm波長處指紋峰較多，多數特征成分的響應值較大，而且基線較平穩，故選擇360nm波長作為指紋圖譜檢測波長。本實驗分別采用甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸水溶液進行梯度洗脫。結果表明，在乙腈-0.2%磷酸水溶液的流動相中，各色譜峰的分布、峰形和分離度均優于其他流動相系統，因此，選擇乙腈-0.2%磷酸水溶液作為流動相。

實驗以盡可能多體現絞股藍中黃酮成分為原則，以提取溶劑、提取方式、提取時間為優化對象，采用單因素試驗確定絞股藍藥材中黃酮類成分提取的最佳條件，最終確定了以石油醚回流除去脂溶性干擾性成分，再以70%甲醇回流提取1.0h效果最好。

通過對10批陜西平利絞股藍藥材HPLC指紋圖譜的分析結果可知，各色譜峰的保留時間匹配較好，且各特征峰的相對含量分布相似，10批絞股藍藥材的總相似度均達到0.98以上，所建立的HPLC指紋圖譜可用于辨別不同產地的絞股藍藥材。

表3 10批絞股藍指紋圖譜中共有特征峰相對保留時間

表4 10批絞股藍指紋圖譜中共有特征峰相對峰面積

[1] 何顯忠,邱江沁.絞股藍化學成分和藥理作用研究進展[J].中國中醫藥信息雜志,2008,15 (S1):84-86.

[2] 孫萬森,吳喜利,喬成林,等.絞股藍總皂苷防治多臟器損傷的藥理研究進展[J].中成藥報,2007,30(2):241-244.

[3] 李金青,楊洪軍.絞股藍的藥理作用研究進展[J].中國現代藥物應用,2009,3(7):189-190.

[4] 丁樹利,朱兆儀,李勇.絞股藍及同屬植物的生藥學研究[J].中國藥學雜志,1994,29(2):79-83.

[5] 陳武,鄒盛勤,吳曉春,等.絞股藍無糖口含片的制備工藝研究[J].食品科學,2008,29(3):245-248.

[6] 楊靜.絞股藍化學成分的研究[J].陜西中醫,2000,21(8):3771-3773.

[7] 陰建.中藥現代研究與臨床應用[M].北京：中醫古籍出版社,1995:524.

[8] 吳宗群,王艷.絞股藍的化學成份和藥理作用研究現狀[J].中華全科醫學，2011,9(1):116-117.

[9] DING SL,ZHU ZY,LI Y.Pharm aceuticalstudy of genus Gynostemma of cucurbitaceous in China[J].Chinese Pharm aceutical Journal,1994,29(2):79-84.

[10] 張曉喻,黎艷,雍彬,等.復方絞股藍皂甙改善小鼠學習記憶的研究[J].食品科學,2007,28(3):330-333.

[11] 周建華,張興亞.絞股藍開發研究新進展及應用[J].食品科技,2010,35(2):74-77.

[12] 王睿.絞股藍皂苷提取工藝研究進展[J].廣西輕工業,2010(7):16-17.

(責任編輯：魏 曉)

Study on the HPLC Fingerprint Spectrum of Flavonoids inGynostemmaPentaphyllum(Thunb.) Makino from Shanxi PingLi

Peng Liang1,Li Yiguang1,2*,Chen Jie1*,Rao Yi1,Ji Qiaoyu1,Wei Huizhen1

(1.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330006,China;2.Jiangzhong Pharmaceutical Corporation,Nanchang 330096,China)

Objective:To establish the HPLC fingerprint spectrum of flavonoids inGynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino.Methods:HPLC was performed on ZORBAX SB-C18column (150mm×4.6mm,5μm),gradiently eluting with acetonitrile as mobile phase A,and 0.2% H3PO4as B at a flow rate of 1.0mL/min.The column temperature was 30℃.The detection wavelength was 360nm.The injection volume was 10μL.Results:Twenty-six common characteristic peaks were demarcated among ten batches ofGynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino.Two chromatographic peaks were identified as rutin and quercetin and the similarities of ten batches ofGynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino were above 0.98.Conclusion:The established method is simple,accurate and can be able to provide reference for quality control ofGynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino.

Shanxi PingLi；GynostemmaPentaphyllum(Thunb.) Makino；Flavonoids；HPLC；Fingerprint Spectrum

2015-05-08

彭亮(1990-),男,江西中醫藥大學碩士研究生,研究方向為中藥質量控制。

李詒光(1974-),男,江中藥業股份有限公司主任中藥師，研究方向為中藥質量評價與開發，E-mail:lyg@jzjt.com；陳杰(1975-),女,江西中醫藥大學副教授,研究方向為中藥質量評價與開發，E-mail:813680107@qq.com。

R284.1

A

1673-2197(2015)19-0019-04

10.11954/ytctyy.201519009