瑞香素對小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的抑制作用

王 佳，黃俊卿

(1.武漢大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430071;2.江西醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，江西 上饒 334000)

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瑞香素對小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的抑制作用

王 佳1,2，黃俊卿2

(1.武漢大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430071;2.江西醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，江西 上饒 334000)

目的：研究瑞香素對小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)的作用，并初步探討其作用機制。方法：采用牛Ⅱ型膠原蛋白建立CIA模型，檢測小鼠足爪炎癥的腫脹度，病理切片HE染色對關(guān)節(jié)組織進行檢查，酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)法檢測血清中腫瘤壞死因子-α和白介素-6的水平。結(jié)果：瑞香素低、中、高劑量灌胃給藥能減輕CIA小鼠關(guān)節(jié)炎癥狀，降低血清中腫瘤壞死因子-α和白介素-6的水平；可減輕局部關(guān)節(jié)炎癥狀。結(jié)論：瑞香素對CIA小鼠具有治療作用，其作用機制可能與其調(diào)節(jié)CIA小鼠異常的免疫功能有關(guān)。

膠原性關(guān)節(jié)炎；瑞香素；炎癥；抑制；免疫功能

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是以慢性、對稱性、多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)，尚未明確病因的全身性炎癥性自身免疫炎性疾病[1]。目前，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療仍以藥物為主，但目前常用的西藥副作用較強，且多數(shù)藥物僅對某一癥狀或某一病理過程有效，有一定局限性。瑞香素主要存在于瑞香科屬植物中，又名祖師麻甲素，為中藥祖師麻的有效成分之一[2]。本研究利用小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型，探究瑞香素對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用及機制。

1 儀器與材料

瑞香素(Daphnetin，DPA純度>90%，上海一基實業(yè)有限公司，批號：20120205)；牛II型膠原(Sigma公司)；BCA蛋白定量試劑盒(Pierce公司)；弗氏不完全佐劑(美國sigma公司)；小鼠TNF-α、IL-6ELISA檢測試劑盒(德國Bender公司)；實驗動物雄性DBA/1小鼠，6～8周齡，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(湘)2012-0016；倒置顯微鏡(XSZ-D 重慶光學(xué)儀器廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 實驗分組及給藥方案

將小鼠隨機分成：正常組、CIA模型組、瑞香素低劑量組(25mg·kg-1)、瑞香素中劑量組(50mg·kg-1)、瑞香素高劑量組(100mg·kg-1)。各組于致炎后第14～28 天灌胃給予與正常組和CIA模型組灌胃等容量的0.5%羧甲基纖維素鈉，每天1次。

2.2 小鼠CIA模型的制備與評價[3]

量取200μg牛II膠原，置于0.05mol·L-1醋酸0.1mL中，震蕩溶解，再與等體積弗氏佐劑充分混合，于小鼠尾根部皮下注射。致敏初次后第14天，小鼠尾根部皮下同體積注射試劑，每天觀察關(guān)節(jié)情況。正常對照組于同時注射同體積磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。評價標(biāo)準(zhǔn)：4分：全部足爪腫脹；3分：踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；2分：足趾和趾關(guān)節(jié)有腫脹；1分：趾關(guān)節(jié)有紅腫；0分：無紅腫。

2.3 足爪容積測定及病理檢查

足爪儀測定致炎前每只小鼠左后足容積，自第14 天起，每四天測定1次相應(yīng)足容積，腫脹度=(Vt-Vn)/Vn×100%，Vn指模型前足容積；Vt指模型后足容積。第28 天處死小鼠后，剪取左踝關(guān)節(jié)制病例切片待查。

2.4 炎性因子的檢測

第1次免疫后第28 天麻醉小鼠，采用摘眼球法取血獲得血清，并按照相應(yīng)試劑盒說明操作，測定血清腫瘤壞死因子-α和白介素-6的水平。

2.5

2.5.1 瑞香素對CIA小鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響 瑞香素可以抑制CIA小鼠繼發(fā)性足腫脹，且抑制程度與劑量成正比，其足爪腫脹度明顯輕于模型組，結(jié)果見表1。

表1 瑞香素對CIA小鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響

2.5.2 病理切片觀察 常規(guī)HE染色病理切片顯微鏡檢見圖1。正常組：(a)滑膜關(guān)節(jié)有完整的結(jié)構(gòu)，軟骨表面完整；(b)細胞排列很規(guī)則。CIA模型組：(c)有滑膜關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞；(d)關(guān)節(jié)軟骨細胞體積變大；(e)有炎性細胞浸潤；(f)纖維組織有增生；(g)形成血管翳；(h)軟骨下骨等組織引致骨關(guān)節(jié)軟骨破壞。瑞香素高劑量組：(i)可見滑膜關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)較完整，關(guān)節(jié)間隙清晰。

圖1 CIA小鼠足關(guān)節(jié)病理切片(×10)

2.5.3 瑞香素對炎性因子表達的影響 經(jīng)ELISA法檢測，相比于正常組，CIA模型組炎性因子腫瘤壞死因子-α和白介素-6的表達顯著增加，瑞香素可劑量依賴性地抑制其表達，結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠血清炎性因子水平

3 結(jié)論

目前，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的動物模型主要包括：Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎及多聚糖蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎等[4]。Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎是一種應(yīng)用廣泛的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎建模方法，在病理條件下，常作為自身抗原引起自身免疫反應(yīng)。本實驗成功建立了小鼠Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型，實驗研究發(fā)現(xiàn)瑞香素對CIA小鼠具有一定的治療作用，其作用機制可能與調(diào)節(jié)CIA小鼠異常的免疫功能有關(guān)。

[1] GABRIEL SE.The epidemiology of rheumatoid arthritis[J].Rheum Dis Clin Noah Am,2001,27(9):269-282.

[2] ZHENG W F,CAO XW,GU Q,et al.Antitumor acivity of daphnodorins from daphen genkwa roots [J].Int Immunopharmacol,2007,7(2):128-134.

[3] 李洪忠,萬敬員,張力,等.積雪草苷對小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的抑制作用[J].藥學(xué)學(xué)報,2007,42(7):698-703.

[4] 鄒文瑋,舒奇,傅穎媛,等.瑞香素毒理學(xué)實驗研究[J].中成藥,2013,35(5):908-910.

(責(zé)任編輯：宋勇剛)

2015-04-23

王佳(1984-)，女，武漢大學(xué)碩士研究生，江西醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校助理實驗師，研究方向為藥理學(xué)。

R285.5

A

1673-2197(2015)19-0013-01

10.11954/ytctyy.201519006