糙米培養(yǎng)蟲草菌絲體技術(shù)及其有效成分含量測(cè)定

莫炫永,陳涌濤

(1.東莞市國(guó)藥質(zhì)量檢測(cè)中心，廣東 東莞 523010；2.湖北省科技信息研究院，湖北 武漢 430071)

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糙米培養(yǎng)蟲草菌絲體技術(shù)及其有效成分含量測(cè)定

莫炫永1,陳涌濤2*

(1.東莞市國(guó)藥質(zhì)量檢測(cè)中心，廣東 東莞 523010；2.湖北省科技信息研究院，湖北 武漢 430071)

冬蟲夏草是一種非常名貴的中藥材，主產(chǎn)于我國(guó)青藏高原，有神山圣草和中藥之王的美譽(yù)，在傳統(tǒng)醫(yī)藥中占據(jù)重要地位。但近幾年，由于過度采挖和生態(tài)環(huán)境的惡化，野生資源幾近枯竭，而蟲草的人工養(yǎng)殖卻一直沒有取得突破，因此尋找其替代品十分重要。探討糙米培養(yǎng)蟲草菌絲體技術(shù)并對(duì)人工培養(yǎng)的蟲草菌絲體的有效成分進(jìn)行了含量測(cè)定。

冬蟲夏草；替代品；蟲草菌絲體；人工培養(yǎng)；有效成分；含量測(cè)定

冬蟲夏草[Cordycepssinensis(Berk.)Sacc]為我國(guó)名貴的傳統(tǒng)滋補(bǔ)強(qiáng)身中藥材，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,其含有多種生物活性物質(zhì)，具有擴(kuò)張血管、降血壓、鎮(zhèn)靜、抗菌、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗衰勞等多種藥理作用。冬蟲夏草為麥角菌科真菌冬蟲夏草寄生在磷翅目昆蟲蝙蝠蛾幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體，是青藏高原地區(qū)的特有物種，主產(chǎn)于我國(guó)西藏、青海、四川、云南、甘肅等地[2-3]。近年來由于過度采挖，導(dǎo)致蟲草野生資源日益枯竭和高原地區(qū)本已脆弱的生態(tài)環(huán)境惡化，并且高額的利潤(rùn)也造成了蟲草行業(yè)的種種亂象，一些假冒偽劣產(chǎn)品充斥市場(chǎng)，甚至一些街頭廣告也宣稱出售正宗野生冬蟲夏草產(chǎn)品，給廣大消費(fèi)者、患者造成嚴(yán)重?fù)p失。因此，開發(fā)蟲草人工養(yǎng)殖技術(shù)或替代品，保護(hù)消費(fèi)者利益，保護(hù)蟲草野生資源和高原生態(tài)環(huán)境非常重要。冬蟲夏草在青藏高原特有的氣候條件下生長(zhǎng)，這些條件都很難用人造環(huán)境再現(xiàn)，這是冬蟲夏草的人工養(yǎng)殖一直沒有取得有效突破的原因之一。但是冬蟲夏草的有效成分大多在它的菌絲體或子實(shí)體中，只要能夠培養(yǎng)出合格的菌絲體或子實(shí)體，也能達(dá)到人工培養(yǎng)冬蟲夏草的目的,這也是現(xiàn)今國(guó)內(nèi)研究的熱點(diǎn)[4]。 本研究對(duì)糙米培養(yǎng)蟲草菌絲體技術(shù)進(jìn)行了實(shí)用化嘗試，并對(duì)人工培養(yǎng)蟲草菌絲體主要有效成分進(jìn)行了含量測(cè)定。

1 材料與儀器

玻璃瓶為蟲草子實(shí)體培養(yǎng)器，可以選用透明罐頭瓶；冬蟲夏草二代菌絲體為特意研發(fā)的適宜在稻米中培養(yǎng)的冬蟲夏草菌種C963，母體來自西藏那曲；紫外燈消毒箱；冰箱；接種工具；酒精燈；糙米；高壓鍋；馬鈴薯；恒溫箱；加濕器；干濕溫度計(jì)；振蕩培養(yǎng)箱。

2 方法與結(jié)果

蟲草菌種很容易受到雜菌感染，所以必須全方位嚴(yán)格消毒，整個(gè)操作過程均在紫外燈下進(jìn)行。將接種工具和培養(yǎng)器瓶口用酒精燈外焰快速烘烤以殺菌。蟲草菌種必須低溫避光保存，裝有蟲草菌原種的試管，用三層以上包裝紙包裹，在冰箱里保存，溫度控制在-18℃以下，在這個(gè)溫度，菌種將處于休眠狀態(tài)。

2.1 菌種培養(yǎng)

蟲草菌種在高溫下無法存活，因此，必須要等接種工具冷卻后才能使用。將少許菌種取出，注入培養(yǎng)器中，培養(yǎng)器中已預(yù)先配有專用培養(yǎng)液，接種后立即封閉瓶口。接下來進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，將接種后的培養(yǎng)器放于振蕩培養(yǎng)箱中。恒溫培養(yǎng)即低溫恒溫培養(yǎng)，是模擬冬蟲夏草的野生環(huán)境，在避光條件下進(jìn)行，培養(yǎng)過程中溫度控制在16～18℃，振蕩培養(yǎng)箱的轉(zhuǎn)速設(shè)定在140r/min。待培養(yǎng)器中出現(xiàn)顆粒狀菌球，菌種培養(yǎng)工作即完成，菌種培養(yǎng)的周期為3～5天。

2.2 子實(shí)體培養(yǎng)

蟲草子實(shí)體培養(yǎng)器選用透明玻璃瓶，以便于觀察生長(zhǎng)境況。本實(shí)驗(yàn)中，蟲草子實(shí)體培養(yǎng)基選用糙米，因?yàn)槲覈?guó)是稻米生產(chǎn)大國(guó)，在糧食運(yùn)輸、加工過程中不可避免會(huì)產(chǎn)生碎米或殘次米，再加上色選機(jī)選出的雜色米和倉庫里堆積的陳米，糧食企業(yè)每年都要為大量糙米的處理發(fā)愁，以往一般都是低價(jià)處理，附加值很低。本研究能有效提高糙米的附加值，提高糧食的利用率。因此，本研究特意研發(fā)了適宜在稻米中培養(yǎng)的冬蟲夏草菌種C963，以及適合在稻米上生長(zhǎng)的冬蟲夏草培養(yǎng)基配方。當(dāng)然，糙米不能直接作為培養(yǎng)基，還要進(jìn)行加工，需要加入土豆湯以及其他一些添加劑，才能有助于營(yíng)養(yǎng)成分的釋放。糙米專用營(yíng)養(yǎng)湯配好后，精密量取55mL湯汁，倒入已經(jīng)裝有50g糙米的玻璃瓶中，再用特殊塑料薄膜將瓶口封閉，這種特殊塑料薄膜帶有4個(gè)小孔，是一種單透膜，即空氣或水分只能從一個(gè)方向通過，封口時(shí)讓膜的通氣由瓶?jī)?nèi)到瓶外。

接下來，將封口后的玻璃瓶碼放起來，送入大型高壓鍋中加熱至124℃，經(jīng)50min殺菌滅活后出鍋；或加熱至糙米蒸熟、土豆湯基本蒸干為宜，這時(shí)培養(yǎng)基的準(zhǔn)備工作即完成。

下一步是給培養(yǎng)基接種，因?yàn)橄x草菌種不耐高溫，這項(xiàng)工作要等培養(yǎng)基完全冷卻后才能進(jìn)行。接種前仍然要先嚴(yán)格消毒，整個(gè)接種工作都要在紫外燈下進(jìn)行。點(diǎn)燃酒精燈，將接種工具在酒精燈外焰上快速烘烤，待接種工具冷卻后從菌種瓶?jī)?nèi)取出少許菌種，打開裝有培養(yǎng)基的玻璃瓶封口，滴入菌種，快速重新裝上封口。接好種的玻璃瓶要分開碼放，以免混淆。

辟出專門的蟲草培養(yǎng)間，嚴(yán)格消毒，裝上空調(diào)、加濕器、溫度計(jì)等設(shè)備，準(zhǔn)備一些貨架。與菌絲體培養(yǎng)需要避光不同，子實(shí)體培養(yǎng)需要采光。將接好種的玻璃瓶整齊碼放至貨架上，調(diào)整空調(diào)和加濕器，控制溫度20℃、濕度80%。子實(shí)體培養(yǎng)期間，人員除例行檢查外，盡量少進(jìn)入培養(yǎng)間，以減少雜菌感染。如果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基長(zhǎng)出了一些黑色的東西，表明受到了感染，如果是早期，剔除這些雜菌斑即可，若感染嚴(yán)重應(yīng)盡快將整瓶移走，以免發(fā)生傳染。

研究表明，只要技術(shù)到位，2個(gè)多月就可以長(zhǎng)出理想的蟲草子實(shí)體。但這些人工培養(yǎng)的蟲草子實(shí)體藥性如何還有待檢驗(yàn)。因?yàn)橄佘蘸拖x草素是蟲草的重要活性成分，其含量測(cè)定對(duì)人工培育蟲草的質(zhì)量控制有重要意義。以下對(duì)這兩種有效成分進(jìn)行了含量測(cè)定，以檢驗(yàn)人工培養(yǎng)蟲草子實(shí)體技術(shù)的實(shí)用價(jià)值。

2.3 蟲草有效成分含量測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)采用的實(shí)驗(yàn)儀器包括Agilent 1200 RRLC-UV-ELSD高效液相色譜儀，賽多利斯萬分之一電子天平,OpenLAB EZchrom色譜數(shù)據(jù)管理系統(tǒng);KQ-600超聲波清洗器;WR-2001型溶劑過濾器,0.2μm濾膜,試劑均為分析純,水為3次蒸餾水。

標(biāo)準(zhǔn)溶液制備:稱取腺苷、蟲草素對(duì)照品適量,置于同一容量瓶中,加乙醇∶水(1∶1)溶液,超聲波振蕩溶解,定容,配制成濃度分別為50.5mg·L-1、129.0mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

蟲草素(C10H13O3N5)和蟲草腺苷(C10H13N5O4)是從蟲草中分離得到的一類具有生物活性的化合物[5]。本研究采用HPLC法測(cè)定人工培養(yǎng)蟲草子實(shí)體和天然冬蟲夏草中蟲草素和腺苷的含量，以Waters XTerra MS C18(4.6mm×250mm，5μm)為色譜柱，以甲醇-水為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速為1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為259nm，柱溫為25℃，結(jié)果人工培養(yǎng)蟲草子實(shí)體中蟲草素和腺苷含量分別為1 089.57μg/g、520.00μg/g。冬蟲夏草中蟲草素和腺苷含量分別為

值接近甚至高于冬蟲夏草，可將人工培養(yǎng)菌絲體作為天然冬蟲夏草的替代品。色譜見圖1、圖2。

圖1 野生蟲草色譜

圖2 人工培育蟲草色譜

3 結(jié)語

野生冬蟲夏草由于被盲目無節(jié)制采挖，現(xiàn)已處于瀕危狀態(tài)，以人工培育的蟲草子實(shí)體代替野生冬蟲夏草，既保持了環(huán)境資源的可持續(xù)發(fā)展，又降低了用藥成本，不僅有可觀的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，而且有重要的社會(huì)效益。本研究表明人工培育的蟲草子實(shí)體在某些藥理作用方面可以替代野生冬蟲夏草，但由于實(shí)驗(yàn)條件及實(shí)驗(yàn)方法的局限，對(duì)人工培育蟲草子實(shí)體替代冬蟲夏草還需進(jìn)一步深入研究。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].一部.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010.

[2] 康廷國(guó).中藥鑒定學(xué)[M].第3版.北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2007:432.

[3] 蔣三俊.冬蟲夏草及蛹蟲草寄主昆蟲資源[J].特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物，2001(5):15.

[4] 康廷國(guó).中藥鑒定學(xué)[M].第2版.北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2007:431.

[5] 張甲生,馬冰茹,何玲,等.蠶蛹蟲草與冬蟲夏草中無機(jī)元素的比較[J].中國(guó)食用菌,10(20):43-44.

(責(zé)任編輯：宋勇剛)

2015-05-10

莫炫永(1974-)，男，碩士，廣東省東莞市國(guó)藥質(zhì)量檢測(cè)中心主管藥師，研究方向?yàn)樗幤贰⒈＝∈称焚|(zhì)量控制。

陳涌濤(1970-)，男，湖北省科技信息研究院助理研究員，研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)科技傳播。

R284.2

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1673-2197(2015)18-0015-02

10.11954/ytctyy.201518008