基于熵權相似度計算法的“江梔子”指紋圖譜研究*

★ 吳璐 黎曉麗 劉婧 方建和 楊華生＊ (江西中醫藥大學 南昌330004)

梔子為茜草科植物梔子(Gardenia jasminoidesEllis.)的成熟果實，始載于《神農本草經》，為中國藥典［1］各版收載的品種，具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒等功效。梔子為江西道地藥材，在我國應用廣泛。近年來，指紋圖譜分析技術由于具有適合從整體上分析復雜化學物質成分的特點，已被美國［2］、WHO［3］、歐盟［4］等國家和組織接受，并用來評價天然藥物質量。目前相似度計算多采用相關系數法或夾角余弦法(相合系數法)。但這兩種方法計算所得的相似度只與各成分之間含量的比值相關，可能會因為不同成分含量的變化而掩蓋了某些特征峰的個性信息，導致其對樣本的區分能力較弱。基于這些缺陷，本研究對傳統的指紋圖譜建立方法進行改進，開發了熵權法用于指紋圖譜相似度的計算，并在中藥“江梔子”上進行了實際應用，成功建立了基于熵權法的“江梔子”藥材指紋圖譜相似度分析方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，Agilent化學工作站(美國);賽多利斯BS 110S型電子分析天平(北京賽多利斯公司)。KQ-250型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 梔子苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110749-201316)，梔子對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號120986-201309)。乙腈(色譜純，國藥集團化學試劑有限公司)、水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。20批梔子藥材(編號1～20)產地均為江西，經江西中醫藥大學付小梅副教授鑒定為茜草科植物梔子(Gardenia jasminoidesEllis.)的成熟果實。

2 方法與結果

2.1 利用信息熵改進指紋圖譜相似度的計算方法

指紋圖譜的相似度計算一般采用相關系數(r)或相合系數法(ρ)，兩者能快速、較好地通過完整指紋圖譜或色譜峰面積(峰高)計算指紋圖譜的相似程度。其計算公式如下:

其中xi為某個樣品對應保留時間下的峰面積或峰高，xj為n批樣品(n大于等于10)對應保留時間下的平均峰面積或峰高，k=1-m，m表示色譜峰數。利用信息熵計算各色譜峰的權重因子，相關系數與相合系數得到優化后的計算公式如下:

公式(6)其中Pij表示第j個樣品指紋圖譜在第i個共有峰總面積中的“概率”。

2.2 色譜條件 Kromasil色譜柱(4.6mm×250mm，5μm);乙腈(A)-水(B，含0.2%磷酸)為流動相，梯度洗脫，洗脫程序為:0～10min 6%A，18 min 12%A，22 min 16%A，28 min 20%A，40 min 20%A，60min 36%A，65 min 55%A;平衡時間10 min;流速為1 mL/min;檢測波長為238 nm，參比波長為580nm;柱溫為30℃;進樣量為5μL。

2.3 樣品的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 取梔子苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含梔子苷0.8mg的對照品溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備 按照文獻方法，分別從溶劑、提取方法2方面考察供試品溶液制備方法。以梔子苷對照品的加樣回收率結果為參考，確定最優制備條件:取本品粗粉約0.4g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25mL，稱定重量，超聲(300W，100Hz)提取30min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，即得。

2.4 指紋圖譜建立的方法學考察

2.4.1 儀器精密度試驗 取對照藥材，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，按2.2項下方法連續測定5次。所有共有峰(占總峰面積90%)的相對峰面積和相對保留時間的RSD均分別小于2.5%，5個指紋圖譜相關系數均大于0.95，表明儀器穩定，精密度良好。

2.4.2 方法重復性試驗 取對照藥材，按2.3.2項下方法制備供試品溶液5份，按2.2項下方法測定。所有共有峰(占總峰面積90%)的相對峰面積和相對保留時間的RSD均分別小于2.5%，5個指紋圖譜相關系數均大于0.95，表明方法的重復性良好。

2.4.3 樣品穩定性試驗 取對照藥材，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，按2.2項下方法分別在0、6、12、18、24h進行測定，梔子苷色譜峰峰面積RSD均小于2.5%，同時指紋圖譜所有共有峰(占總峰面積90%)的相對峰面積和相對保留時間的RSD均小于2.5%，指紋圖譜相關系數均大于0.95，表明供試品溶液在24h內基本穩定。

2.5 樣品指紋譜圖的建立 取對照藥材及20批藥材樣品，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，按2.2項下方法進行測定，得到標準指紋圖譜和20批梔子藥材的指紋圖譜，如圖1～3所示。

圖1 對照品圖譜

圖2 對照藥材指紋圖譜

圖3 20批藥材指紋圖譜

2.5 基于熵權法的“江梔子”指紋圖譜相似度研究

根據分離度高、特征性強的原則，篩選出11個色譜峰，11個共有峰的最小分離度均大于1.5，梔子苷對照峰(7號峰)的理論塔板數大于3000。以梔子對照藥材的指紋圖譜為標準模式，以梔子苷為對照峰計算各峰的相對峰面積，以面積歸一化法計算各峰的相對百分含量，把信息熵引入了相似度算法確定各特征峰的權重(表1)，并計算出各樣品與江梔子標準模式的相似度(表2)。

表1 各特征峰的權重

表2 熵權法與傳統方法的相似度計算結果比較

由圖3與表1可知，加權的方法能夠較好地反映出各特征峰的重要程度，其中7號梔子苷峰因其在共有指紋峰中所占面積比例大，分散度小，其相對權重被大大降低，而2、6、8號峰因它們的分布較為分散，相對權重較大，反映了它們對整體判斷的重要性。以梔子對照藥材的指紋圖譜作為標準圖譜，20批樣品用傳統相似度計算法和熵權相似度計算法算得的相關系數與相合系數均在0.95以上，說明江西產梔子藥材的化學組成一致性較好，質量較穩定，道地性強。

3 討論

本研究曾考察了甲醇、75%甲醇、乙醇、75%乙醇4種提取溶劑及不同提取時間的提取效果，結果75%甲醇超聲提取30min的提取效果最好。分別考察了甲醇-水及乙腈-水流動相系統，結果表明乙腈-水系統分離效果較好，各峰的保留時間適中，分離度較好，且基線穩定，有利于指紋圖譜的分析。

用傳統的相似度算法來進行中藥材指紋圖譜分析時，當某些成分較其它成分含量高很多，且批次之間變化不明顯時，人們往往忽略了指紋圖譜中那些低含量成分峰面積變化對指紋圖譜整體的影響，從而導致對藥材道地性的誤判，如何有效地反映各成分對指紋圖譜變化的影響程度，是解決問題的關鍵。把信息熵加權的方法引入相似度算法中，獲得各色譜峰的權重，不僅可以直接采用所有色譜峰(或全譜)數據來計算，而且使所得的相似度更加客觀合理。本研究結果表明，利用熵權相似度計算法研究“江梔子”指紋圖譜、識別其道地性是可行的，本法為“江梔子”道地性識別提供了又一種科學的參考，擴展了指紋圖譜的應用領域。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典·一部［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:231.

［2］CDER.Guidance for industry botanical drug products［Z］.Rockville:FDA，2004.

［3］WHO.Guidelines for the Assessmen to fherbal medicines［Z］.Geneva:WHO，1991.

［4］HMPWP.Final proposals for Revision of the Note for Guidance on Quality of Herbal Remedies［Z］.London:EMEA，1998.

［5］吳璐，楊華生.基于信息熵理論的中藥提取工藝研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18(9):29-31.

［6］邱菀華.管理決策與應用熵學［M］.北京:機械工業出版社，2002:10.