生物刺激與生物強(qiáng)化聯(lián)合修復(fù)柴油污染土壤

高 闖，張 全

（1. 遼寧石油化工大學(xué) 石油化工學(xué)院，遼寧 撫順 113001；2. 中國石化 撫順石油化工研究院，遼寧 撫順 113001）

生物刺激與生物強(qiáng)化聯(lián)合修復(fù)柴油污染土壤

高 闖1，2，張 全2

（1. 遼寧石油化工大學(xué) 石油化工學(xué)院，遼寧 撫順 113001；2. 中國石化 撫順石油化工研究院，遼寧 撫順 113001）

從柴油污染土壤中篩選分離出一株高效降解柴油的菌株CY-1，考察了自然衰減修復(fù)、生物刺激修復(fù)、生物強(qiáng)化修復(fù)以及生物刺激-生物強(qiáng)化聯(lián)合修復(fù)等4種修復(fù)方法對土壤中柴油的降解能力及降解過程中幾種土壤微生物酶活性的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該菌為假單胞菌屬；采用生物刺激-生物強(qiáng)化聯(lián)合修復(fù)初始柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.70%的柴油污染土壤，經(jīng)過31 d的降解，柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)降至1.09%，柴油去除率達(dá)59.6%；經(jīng)生物刺激-生物強(qiáng)化聯(lián)合修復(fù)，土壤脫氫酶活性和熒光素二乙酸酯水解酶活性最高；通過生物刺激處理可使土壤脲酶活性和磷酸酶活性達(dá)到最高。

柴油污染土壤；生物修復(fù)；生物刺激；生物強(qiáng)化；酶活性

柴油進(jìn)入土壤后會影響土壤的生態(tài)循環(huán)能力［1］，暴露于環(huán)境中還會對人類身體健康造成危害［2-3］。土壤生物修復(fù)技術(shù)是美國環(huán)境總署推薦的優(yōu)選土壤修復(fù)技術(shù)之一。目前，單純針對柴油開展的生物刺激研究較少，大部分生物刺激的研究是關(guān)于石油降解方面的。Diaz-Martinez等［4］研究了生物刺激、生物強(qiáng)化以及植物聯(lián)合修復(fù)柴油污染土壤的過程，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，合適的添加劑能刺激接種菌的生長，提高植物修復(fù)效率。Dias等［5］對南極洲的柴油污染土壤進(jìn)行了生物刺激原位修復(fù)的研究，45 d內(nèi)柴油降解率可達(dá)49%。Zhang等［6］從原油污染土壤中獲得了兩株能以柴油為唯一碳源生長的菌株，降解15 d后，柴油降解率達(dá)70%。

本工作從柴油污染土壤中篩選、分離出一株高效降解柴油的菌株CY-1，考察了自然衰減修復(fù)、生物刺激修復(fù)、生物強(qiáng)化修復(fù)以及生物刺激與生物強(qiáng)化相結(jié)合的聯(lián)合修復(fù)等方法對柴油污染土壤的修復(fù)過程，對比了不同修復(fù)方法的柴油降解效果及土壤酶活，為修復(fù)過程的強(qiáng)化提供了依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑、材料和儀器

丙酮、正己烷：分析純。

土樣：取自某市加油站附近的柴油污染土壤，柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.70%；0#柴油：購自中國石化加油站。

土壤營養(yǎng)液：以KH2PO4和NH4NO3配制，加入后使土壤中的n（C）∶n（N）∶n（P）= 100∶1.25∶1。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0，121 ℃滅菌15 min，保存?zhèn)溆谩?/p>

無機(jī)鹽培養(yǎng)基：KH2PO41.0 g，K2HPO41.0 g，NH4NO31.0 g，MgSO40.5 g，CaCl20.01 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0，121 ℃滅菌15 min，保存?zhèn)溆谩?/p>

在上述培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂，即得相應(yīng)的固體培養(yǎng)基。

6010型紫外-可見分光光度計(jì)：惠普公司；GC-2010型氣相色譜儀：日本島津公司；CEM型微波萃取儀：美國培安公司。

1.2 柴油降解菌的篩選及鑒定

向10 g柴油污染土壤中加入100 mL滅菌后的生理鹽水，在溫度為30 ℃、轉(zhuǎn)速為170 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)24 h。加入經(jīng)孔徑為0.22 μm的微孔濾膜過濾滅菌的柴油3 mL，再放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天加入滅菌柴油并持續(xù)培養(yǎng)3 d。將獲得的泥漿用滅菌生理鹽水逐級稀釋，吸取0.1 mL涂布在LB固體培養(yǎng)基平板上，在培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)24 h，利用平板劃線法分離單菌落。

將各純化后的菌株分別接種于含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的過濾滅菌柴油的30 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在溫度為30 ℃、轉(zhuǎn)速為170 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)，觀察其生長情況。將生長情況良好的菌株制備成菌懸液。用生理鹽水重懸浮并調(diào)節(jié)菌懸液濃度，使其在600 nm處的吸光度（OD600）為1.0。

在80 cm2×20 cm的桶內(nèi)裝入300 g柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.70%的污染土壤，控制土床高度約為5 cm。在桶內(nèi)添加10 mL菌懸液。將加入不同菌液的土壤試樣置于培養(yǎng)箱中，在溫度為25 ℃的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，10 d后取樣測定土壤中柴油含量，觀察比較降解效果。

菌株的鑒定工作委托中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司完成。

1.3 柴油污染土壤的修復(fù)

實(shí)驗(yàn)設(shè)置自然衰減組、生物刺激組、生物強(qiáng)化組以及生物刺激-生物強(qiáng)化組等4組土壤試樣，各組的修復(fù)方法見表1。將柴油污染土壤分別按照表1中的4種方法處理后，置于25 ℃培養(yǎng)箱中，過夜后作為實(shí)驗(yàn)起始點(diǎn)，每天翻動土壤并加入去離子水使土壤中的水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%±2%。

表1 土壤試樣的修復(fù)方法

1.4 分析方法

1.4.1 菌濃度的測定

以細(xì)菌培養(yǎng)液的OD600值表征培養(yǎng)液中的菌濃度。

1.4.2 柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

以體積比為1∶1的丙酮和正己烷混合溶液作為萃取劑，采用微波萃取儀萃取土壤中的柴油。用氣相色譜儀測定萃取劑中的柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算得到土壤中的柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)。氣相色譜條件：進(jìn)樣口溫度300 ℃，檢測器溫度300 ℃，色譜柱規(guī)格30 m×0.53 mm，柱溫40 ℃保持2 min，以15 ℃/ min的速率梯度升溫至290 ℃，保持3 min，進(jìn)樣量1 μL。

1.4.3 土壤酶活的測定

1.4.3.1 土壤脫氫酶活性的測定

通過測定土壤中微生物的脫氫酶活性以確定微生物對有機(jī)污染物的氧化分解能力，具體方法見文獻(xiàn)［7］，以反應(yīng)液于486 nm處的吸光度（OD486）表征土壤的脫氫酶活性。

1.4.3.2 土壤熒光素二乙酸酯水解酶活性的測定

通過熒光素二乙酸酯（FDA）水解酶活性表征微生物活性的方法已逐步應(yīng)用到植物殘?bào)w、土壤、河底沉積物、活性污泥以及深海底泥的微生物活性分析中。具體方法見文獻(xiàn)［8］，以反應(yīng)液于490 nm處的吸光度（OD490）表征土壤FDA水解酶的活性。

1.4.3.3 土壤脲酶活性的測定

在土壤的氮素循環(huán)中，脲酶是唯一的底物為尿素的酶類，屬于氮素轉(zhuǎn)化以及循環(huán)中最重要的酶類。通過測定脲酶活性可以定量評價(jià)土壤肥力的高低。測定方法：將2 g風(fēng)干土壤置于50 mL離心管中，加入600 μL甲苯，完全潤濕土壤，靜置15 min。然后加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的尿素溶液和4 mL pH=6.7的檸檬酸緩沖液，搖勻。在培養(yǎng)箱中于溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速145 r/min條件下振蕩反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后加入38 ℃熱水至20 mL，振蕩后經(jīng)孔徑為0.45 μm的微孔濾膜過濾。取1 mL濾液至25 mL定容管中，加入少許去離子水，并加入4 mL苯酚鈉溶液和3 mL次氯酸鈉溶液，充分搖均。靜置20 min后，溶液變?yōu)榈宸铀{(lán)色，加水至刻度，混勻后測定溶液在578 nm處的吸光度（OD578），以此表征土壤脲酶的活性。

1.4.3.4 土壤磷酸酶活性的測定

磷酸酶屬于生物界廣泛存在的酶類，能參與土壤中無機(jī)磷的釋放循環(huán)，并能催化磷酸單酯鍵的水解，在磷素循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。具體測定方法見文獻(xiàn)［9］，以反應(yīng)液于510 nm處的吸光度（OD510）表征土壤磷酸酶的活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 柴油降解菌的篩選及鑒定

經(jīng)過富集培養(yǎng)，在LB固體培養(yǎng)基平板上得到6株能以柴油為碳源生長的菌株，分別命名為CY-1～6。6株菌的生長曲線見圖1。由圖1可見，菌株CY-3生長情況最好，而菌株CY-2和CY-6生長情況較差。因此，選擇菌株CY-1，CY-3，CY-4，CY-5進(jìn)行柴油降解實(shí)驗(yàn)。

圖1 6株菌的生長曲線

加菌10 d后土壤中的柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)見圖2。由圖2可見，經(jīng)過10 d的生物強(qiáng)化處理，添加CY-1菌液的土壤的柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，為1.56%。結(jié)合圖1和圖2的結(jié)果，選擇菌株CY-1作為高效柴油降解菌。

圖2 加菌10 d后土壤中的柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)

經(jīng)16S rDNA基因序列鑒定CY-1為假單胞菌屬。革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該菌為革蘭氏陰性菌。

2.2 修復(fù)方法對柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

修復(fù)方法對柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響見圖3。由圖3可見：隨降解時(shí)間的延長，自然衰減組中的柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不大，基本維持在2.50%左右，這是由于柴油易被土壤表面吸附，不利于自然揮發(fā)［10］；降解時(shí)間為31 d時(shí)，經(jīng)生物強(qiáng)化處理后的柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)降至1.29%，經(jīng)生物刺激處理后的柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.45%，經(jīng)生物刺激-生物強(qiáng)化聯(lián)合修復(fù)的土壤中的柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.09%，柴油去除率為59.6%。由此可見，采用生物刺激-生物強(qiáng)化聯(lián)合修復(fù)柴油污染土壤的效果最好。

圖3 修復(fù)方法對柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.3 修復(fù)方法對脫氫酶活性的影響

修復(fù)方法對脫氫酶活性的影響見圖4。由圖4可見：自然衰減組的脫氫酶活性始終保持較低水平；經(jīng)生物刺激處理后，脫氫酶活性有所增加，但活性低于生物強(qiáng)化處理的酶；經(jīng)生物刺激-生物強(qiáng)化聯(lián)合處理后的脫氫酶活性最高。前期對土壤中柴油的降解主要是由加入的降解菌來完成，后期則是土著菌群發(fā)揮了降解作用。添加營養(yǎng)源有利于降解菌株以及土壤本身土著微生物的生長，促進(jìn)了脫氫酶活性的增加。

圖4 修復(fù)方法對脫氫酶活性的影響

2.4 修復(fù)方法對FDA水解酶活性的影響

修復(fù)方法對FDA水解酶活性的影響見圖5。由圖5可見：各種修復(fù)方法處理的前5 d，F(xiàn)DA水解酶活性均較低，這說明柴油污染物對微生物活性的影響較大；自然衰減組的FDA水解酶一直維持在較低的水平；經(jīng)生物強(qiáng)化處理后的FDA水解酶活性前期較低，后期隨著污染物的降解，土壤微生態(tài)得以恢復(fù)；隨降解時(shí)間的延長，經(jīng)生物刺激處理和生物刺激-生物強(qiáng)化聯(lián)合處理后的FDA水解酶活性的增長趨勢相近，由于降解菌的加入，在降解后期生物刺激-生物強(qiáng)化聯(lián)合處理后的FDA水解酶活性高于生物刺激處理。

圖5 修復(fù)方法對FDA水解酶活性的影響

2.5 修復(fù)方法對脲酶活性和磷酸酶活性的影響

修復(fù)方法對脲酶活性和磷酸酶活性的影響分別見圖6和圖7。由圖6和圖7可見：在4種處理方式中，通過生物刺激處理后的脲酶活性和磷酸酶活性最高，說明添加適當(dāng)比例的養(yǎng)分對于土壤養(yǎng)分循環(huán)的恢復(fù)作用明顯；而只通過生物強(qiáng)化處理，在整個(gè)降解過程中，脲酶活性和磷酸酶活性均未得到明顯恢復(fù)。

圖6 修復(fù)方法對脲酶活性的影響

圖7 修復(fù)方法對磷酸酶活性的影響

3 結(jié)論

a）從柴油污染土壤中分離出一株高效降解柴油的菌株CY-1，經(jīng)鑒定為假單胞菌屬。

b）采用生物刺激-生物強(qiáng)化聯(lián)合處理方法修復(fù)柴油污染土壤的效果最好。在初始土壤中柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.70%的條件下，經(jīng)過31 d的降解，柴油質(zhì)量分?jǐn)?shù)降至1.09%，柴油去除率59.6%。

c）經(jīng)生物刺激-生物強(qiáng)化聯(lián)合修復(fù)，土壤脫氫酶活性和FDA水解酶活性最高；通過生物刺激處理可使土壤脲酶活性和磷酸酶活性達(dá)到最高。

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（編輯 王 馨）

Remediation of Diesel Contaminated Soil by Bio-Stimulation and Bio-Augmentation

Gao Chuang1，2，Zhang Quan2
（1. College of Petrochemical Engineering，Liaoning Shihua University，F(xiàn)ushun Liaoning 113001，China；2. SINOPEC Fushun Petrochemical Research Institute，F(xiàn)ushun Liaoning 113001，China）

A diesel-degrading strain （CY-1） was isolated from the diesel-contaminated soil. 4 different processes were used for bioremediation of diesel-contaminated soil，such as: nature attenuation，bio-stimulation，bio-augmentation，and bio-stimulation-bio-augmentation. The degradation of diesel in soil and the change of enzyme activities of soil microorganism in the 4 degradation processes were studied. The experimental results show that：The strain CY-1 is identified as genusPseudomonas；When the diesel-contaminated soil with 2.70% of initial diesel mass fraction has treated by the bio-stimulation-bio-augmentation combination process for 31 d，the diesel mass fraction is deceased to 1.09%，the diesel removal rate reaches 59.6%；The enzyme activities of soil dehydrogenase and f uorescein diacetate（FDA） hydrolase are the highest in the bio-stimulation-bio-augmentation combination process；While the enzyme activities of soil urease and phosphatase are the highest in the bio-stimulation process.

diesel contaminated soil；bioremediation；bio-stimulation；bio-augmentation；enzyme activity

X172

A

1006 - 1878（2015）02 - 0142 - 05

2014 - 09 - 02；

2014 - 12 - 10。

高闖（1987—），男，遼寧省撫順市人，碩士生，電話 18741390633，電郵 573088322@qq.com。