HPLC法測定刺五加糖漿中五味子醇甲的含量

康宏玲，王志強

(1.沈陽工學院生命工程學院，遼寧撫順 113122;2.撫順市消防支隊清原縣消防大隊，遼寧撫順 113300)

刺五加糖漿為益氣健脾、補腎安神的方劑，主要用于脾腎陽虛、體虛乏力、食欲不振、腰膝酸軟、失眠多夢，其主要成分為刺五加浸膏、五味子浸膏［1］，原標準只是對刺五加苷含量進行測定，并沒有測定其中五味子相關成分的報道，方劑五味子中的木脂素類化合物為其有效成分，具有益氣生津、收斂固澀、補腎寧心的功效［2］，其中五味子中木脂素類化合物以五味子醇甲的含量居高［3］。筆者采用RP－HPLC法測定刺五加糖漿中五味子醇甲的含量，以便對其方劑的品質進行更好的了解和監督，為刺五加糖漿的質量控制提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent HP1100高效液相色譜儀(配有四元梯度泵、在線真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器);ES－120型電子天平(沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司);超純水發生系統(MILLIPORE公司);DHG－9023A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司);TurboVapLV氮氣吹干儀(Zymark公司);CX－300W超聲波清洗機(北京市醫療設備二廠);LG10－2.4A型高速離心機(北京醫用離心機廠);一次性使用無菌注射器(上海凱樂輸液器廠);Ф13 mm 0.22 μm一次性微孔樣品過濾膜(希波氏)。

1.2 試藥 刺五加糖漿(哈爾濱東方制藥有限公司);乙腈，色譜純(Fisher Chemicals公司);甲醇，色譜純(Fisher Chemicals公司)，五味子醇甲為化學對照品(中國藥品生物制品檢定所);無水乙醇，分析純(安徽安特生物化學有限公司);乙酸乙酯，分析純(國藥集團化學試劑有限公司);水為超純水。

1.3 試驗方法

1.3.1 對照品溶液的制備。標準儲備液1 000 μg/ml:準確稱取五味子醇甲標準品0.010 0 g，加入乙腈溶解轉移于10 ml容量瓶中定容至刻度，混勻，制備成1 000 μg/ml的對照品溶液，備用。

1.3.2 供試品溶液的制備。取刺五加糖漿10 ml于比色管中，加水10 ml，用10 ml乙醇溶液萃取5次，合并每次乙醇萃取液，揮干乙醇液，將殘渣用乙腈定容于25 ml容量瓶中，混勻，取適量溶液進行高速離心分離后經0.22 μm微孔濾膜過濾上層清液后待測。

1.3.3 色譜條件。色譜柱為Diamonsil(鉆石)C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，迪馬公司)，流動相為乙腈和水，流動相配比為乙腈∶水=50∶50(V/V);DAD檢測器，檢測波長為216 nm;流速為0.8 ml/min;進樣量為10 μl;柱溫為25℃。

1.3.4 方法學考察。

1.3.4.1 標準曲線的繪制。分別精密吸取五味子醇甲標準儲備液0.01、0.02、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00 ml于10 ml容量瓶中，加入乙腈溶解定容混勻，分別取10 μl注入高效液相色譜儀中進樣分析，以進樣濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.4.2 精密度試驗。準確吸取標準溶液(1.00 μg/ml)按照“1.3.3”色譜條件連續進樣分析6次，測定峰面積并計算RSD值。

1.3.4.3 穩定性試驗。準確吸取供試品溶液在0、4、10、14、18、22、24 h分別進樣分析，測定峰面積，計算其RSD值。

1.3.4.4 重復性試驗。取同一供試品樣品8份，按照“1.3.2”方法制備溶液進樣分析，測定峰面積，計算其RSD。

1.3.4.5 回收率試驗。試驗采用標準加入法進行回收率試驗。取已知含量的供試品樣品6份(五味子醇甲的含量為40.12 μg/ml)，每份準確量取 10.00 ml，加入200 μg/ml標準溶液2.00 ml，按照“1.3.2”方法制備樣品溶液，制成加樣供試品，取加樣供試品10 μl，注入高效液相色譜儀中進樣分析，測定五味子醇甲的加標回收率并計算RSD值。

1.3.5 樣品含量測定。取5批供試品樣品，按照“1.3.2”方法處理樣品，在“1.3.3”色譜條件下進樣分析，測定樣品中五味子醇甲的含量。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 標準曲線的繪制。通過繪制標準曲線，得到五味子醇甲的線性回歸方程為Y=68.654X－5.127，相關系數為0.999 7，由此可以看出五味子醇甲的線性關系良好，可以滿足日常分析的要求。

2.1.2 精密度試驗。在相同條件下對對照品連續進樣6次，結果五味子醇甲峰面積的RSD值為0.8%，表明該儀器的精密度良好，測定結果可靠。

2.1.3 穩定性試驗。經測定不同時間的供試品溶液，結果五味子醇甲峰面積的RSD值為1.3%，表明供試品溶液在24 h內可以穩定存在。

2.1.4 重復性試驗。取同批次樣品8份，在同一試驗條件下進樣測定，得出五味子醇甲峰面積的RSD值為0.9%，可見該方法的重復性良好。

2.1.5 回收率試驗。從五味子醇甲加標回收率的結果(表1)可知，其平均加標回收率為96.32%，RSD值為2.3%，表明該方法精密度和準確度高，可滿足分析檢測的要求。

表1 五味子醇甲的加標回收率

2.2 樣品含量測定 在確定的最佳試驗條件下，5批次供試品中五味子醇甲含量的測定結果分別為40.12、42.06、41.29、39.84、42.81 μg/ml(n=3)。

3 討論

3.1 流動相組成的確定 在高效液相色譜分析中，流動相的恰當選擇對改善分離效果起到重要的作用。從實用角度考慮，流動相的溶劑應當使用安全、容易購得、純度高。除此之外，流動相溶劑應使色譜柱的柱效不受影響，保持色譜柱的穩定。該試驗考察了甲醇－水和乙腈－水2種流動相體系對樣品分離情況的影響，結果表明在相同配比的2種流動相體系中應用乙腈－水為流動相會使分析時間大大減少，并能有效地改善峰形，使峰形變窄，對稱性好，且分離度和洗脫的效果更好，減小了包峰和拖尾的現象，所以該試驗采用乙腈－水為流動相。

3.2 流動相配比的確定 試驗考察了不同流動相配比對樣品分離的影響，發現當流動相配比中乙腈的比例過小，會增加分析時間，使色譜峰變寬，但乙腈的比例過大，使樣品中五味子醇甲與周圍干擾物質無法分離，出現嚴重的包峰現象，綜合考慮分離度、時間和峰形等因素，試驗選擇乙腈∶水=50∶50的流動相配比。從圖1可看出，在13.7 min時均出現五味子醇甲的色譜峰，且樣品中五味子醇甲與周圍干擾峰分離良好。

3.3 流速的確定 流動相的流速會對色譜柱的保留時間、柱效能及柱壓產生影響。該試驗分別考察了0.6、0.8、1.0、1.2 ml/min 4種流速下對保留時間、柱效能及柱壓的影響，結果表明流速增大，五味子醇甲的保留時間縮短，但柱壓升高;流速太小，柱壓減小，但色譜峰加寬，分析速度慢，當流速為0.8 ml/min時，理論塔板數最大，柱效能最好，為此試驗選擇0.8 ml/min為最佳流速。

3.4 進樣量的確定 在高效液相色譜中，進樣量是影響檢測器靈敏度的重要因素之一。此外，進樣量的大小還會影響色譜峰的峰形，甚至影響分離度。進樣量太小，被測物質不易被檢出，靈敏度低;進樣量太大，易發生峰變形、拖尾等現象，使色譜峰對稱性下降。該試驗以樣品溶液分別進樣5、10、15、20 μl比較不同進樣量對色譜分離的影響，結果發現當進樣量＞15 μl時，五味子醇甲的色譜峰變寬，與周圍干擾物質達不到良好的基線分離，為此試驗考慮分離度和靈敏度等因素選擇10 μl為最佳進樣量。

3.5 柱溫的確定 柱溫是影響分離效能和分析速度的重要參數，該試驗分別考察了柱溫在20、25、30、35℃時對樣品中各種物質分離度的影響，發現樣品中五味子醇甲在25℃時與周圍物質的分離度和柱效能最好，當溫度＞30℃時分離度均小于1.0，說明分離不好，所以試驗選擇25℃為最佳柱溫。

3.6 樣品萃取溶劑的確定 試驗中根據五味子醇甲的理化性質和相關參考文獻，分別試用了甲醇、乙醇、乙酸乙酯作為萃取溶劑，結果發現甲醇的揮發速度很快，且檢測波長在216 nm時出現甲醇溶劑峰的干擾，乙酸乙酯作為萃取溶劑，萃取效果不佳，使測定結果明顯偏低，為此該試驗選擇乙醇為萃取溶劑。

［1］張旭東，王蕊，張淑慧.復方刺五加糖漿的制備［J］.河北醫藥，2008，30(9):1418－1419.

［2］靳杰.中藥五味子的研究進展［J］.黑龍江醫藥，2005，18(5):335.

［3］付紹平，張峰，張慧，等.反相高效液相色譜法測定五味子中木脂素的含量［J］. 現代中藥研究與實踐，2004，18(S1):32－34.