實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測黑參對(duì)S180荷瘤小鼠TNF-αmRNA表達(dá)的影響*

袁 媛，黃 赫，甘 雨，王 菲

(遼寧省中醫(yī)藥研究院，遼寧 沈陽 110034)

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實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測黑參對(duì)S180荷瘤小鼠TNF-αmRNA表達(dá)的影響*

袁 媛，黃 赫，甘 雨，王 菲

(遼寧省中醫(yī)藥研究院，遼寧 沈陽 110034)

目的 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測黑參對(duì)S180腫瘤模型小鼠TNF-αmRNA表達(dá)的影響，應(yīng)用分子生物學(xué)手段分析黑參抑制腫瘤的機(jī)制。方法 采取腋下注射S180腫瘤細(xì)胞制得小鼠腫瘤模型，隨機(jī)分成空白對(duì)照組、環(huán)磷酰胺組、消癌平組、紅參高劑量組、紅參中劑量組、紅參低劑量組、黑參高劑量組、黑參中劑量組和黑參低劑量組。除空白對(duì)照組外，其他實(shí)驗(yàn)組均采取同時(shí)灌胃給藥。測定小鼠給藥前后體重、給藥后瘤重，計(jì)算抑瘤率，利用IDTDNA設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測不同組TNF-α表達(dá)豐度。結(jié)果 與空白對(duì)照組相比，所有實(shí)驗(yàn)組腫瘤質(zhì)量都有所減少。除消癌平和環(huán)磷酰胺外，使用高劑量黑參和低、中劑量紅參對(duì)腫瘤重量的抑制較為顯著(P<0.01)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示，同對(duì)照組及其他實(shí)驗(yàn)組相比，高劑量黑參組和低劑量紅參組TNF-α表達(dá)量上調(diào)(P<0.01，P<0.05)。結(jié)論 綜上，使用高劑量黑參和低劑量紅參能夠提高小鼠TNF-α轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平并減少腫瘤重量，其中高劑量黑參組效果更明顯。

黑參；抗腫瘤；熒光實(shí)時(shí)定量；TNF-α

人參(PanaxginsengC.A.Meyer)為五加科植物人參的干燥根，是亞洲常見藥材，具有很高的藥用價(jià)值和歷史文化價(jià)值，被譽(yù)為“草藥之王”，在科學(xué)研究領(lǐng)域和國際市場一直占有極其重要的地位，已經(jīng)被傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)乃至全世界廣泛應(yīng)用。其性平，味甘、微苦，微溫，用于大補(bǔ)元?dú)狻?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津止渴、安神益智。現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)和藥理學(xué)研究表明，人參具有提高機(jī)體免疫力、抗疲勞、抗腫瘤、降血糖以及抗炎等多種活性，因此在醫(yī)學(xué)及養(yǎng)生方面具有可觀的價(jià)值。近年來，各種各樣的人參炮制品作為功能食品用于飲食文化中，其中包括白參、紅參、黑參等。黑參是利用傳統(tǒng)的九蒸九曝炮制方法將人參反復(fù)蒸制烘干而得到的一種人參深加工品，是繼紅參后的又一新人參商品[1]。有文獻(xiàn)報(bào)道，黑參比白參和紅參有更強(qiáng)的抗腫瘤、抗炎、提高免疫力等生物活性。黑參具有很好的開發(fā)前景。

當(dāng)人體受到某些外界不利因素影響，局部的細(xì)胞會(huì)發(fā)生失控性增殖而形成的新生物即腫瘤，常伴有腫塊。腫瘤有良性和惡性之分，良性腫瘤通常可通過手術(shù)切除，而惡性腫瘤往往會(huì)導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。由于惡性腫瘤難以治療和較高的死亡率，已成為21世紀(jì)人類的第一大殺手。正是因?yàn)槿绱耍碌挠行У目鼓[瘤藥物的研發(fā)勢(shì)在必行。黑參的炮制方法各不相同，但大多是將鮮人參經(jīng)過多次蒸曬而成的外觀和化學(xué)成分發(fā)生改變的一類人參新炮制品。研究顯示黑參除了具有提高免疫力、對(duì)抗炎癥反應(yīng)、防氧化、保護(hù)神經(jīng)等功能，在抗腫瘤方面也發(fā)揮重要作用[2-5]。腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌，對(duì)腫瘤細(xì)胞有抑制和殺傷的功效，可被用來研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[6]。本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測黑參對(duì)S180腫瘤模型小鼠TNF-α mRNA表達(dá)，從分子水平探討黑參抗腫瘤機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 腫瘤細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 S180腫瘤細(xì)胞購自上海；SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)小鼠90 只，(21±3)g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(遼)2010-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 實(shí)驗(yàn)所用黑參和紅參溶液為遼寧省中醫(yī)藥研究院科研制備。消癌平(南京圣和藥業(yè)有限公司，批號(hào)：201304241)，刮去糖衣研成粉末待用；環(huán)磷酰胺(通化茂祥制藥有限公司，批號(hào)：130201)，刮去糖衣研成粉末待用；紅參購自遼寧省中醫(yī)藥研究院中藥局；黑參按以往研究自制得到[2]。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 羅氏MPLC 2.0全自動(dòng)核酸分離純化系統(tǒng)(德國羅氏公司)；羅氏LC480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(德國羅氏公司)；羅氏組織勻漿儀(德國羅氏公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑 羅氏RNA純化試劑盒(組織用)貨號(hào)03330591001；羅氏反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA合成試劑盒貨號(hào)04896866001；羅氏組織勻漿儀用鑼蓋管貨號(hào)03358941001、羅氏SYBR GREEN染料貨號(hào)04707516001；引物由本研究組設(shè)計(jì)，并由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 構(gòu)建S180荷瘤小鼠模型和給藥 分組前稱重，將90只小鼠按體重分為9組，即正常對(duì)照組、環(huán)磷酰胺組、消癌平組、紅參低劑量組、紅參中劑量組、紅參高劑量組、黑參低劑量組、黑參中劑量組、黑參高劑量組。注射S180瘤株前外科手術(shù)器械高壓滅菌。S180瘤株經(jīng)生理鹽水洗滌和活細(xì)胞計(jì)數(shù)后，在超凈工作臺(tái)中經(jīng)小鼠腋下注射接種。正常對(duì)照組只構(gòu)建腫瘤模型但不給藥，消癌平組和環(huán)磷酰胺組給藥量均為25 mg/kg(按成人每天服用量換算)，每天1次，連續(xù)10天。紅參低、中和高劑量組小鼠給藥量分別為13.6 g/kg生藥量、27.2 g/kg生藥量和40.8 g/kg生藥量，每天1次，連續(xù)10天；黑參低、中和高劑量組小鼠給藥量分別為13.6 g/kg生藥量、27.2 g/kg生藥量和40.8 g/kg生藥量，每天1次，連續(xù)10天。

2.2 抑瘤率計(jì)算 小鼠給藥第10天，禁食不禁水，第11天稱量體重，用頸椎脫臼法處死小鼠，打開胸腔，完整剝離腋下腫瘤塊、稱取瘤塊重量、拍照后將其凍存于-80℃冰箱待檢。根據(jù)稱得的重量，計(jì)算抑瘤率(inhibitory rate，IR)。計(jì)算公式為IR=(1-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重×100%。

2.4 提取瘤塊總RNA及cDNA的獲得 首先啟動(dòng)全自動(dòng)核酸分離純化系統(tǒng)，進(jìn)行自動(dòng)涂油脂(每次實(shí)驗(yàn)前)和漏液檢測(每個(gè)月一次)。檢查無故障后，選取小鼠新鮮瘤塊組織，每組選3個(gè)，在電子天平上分別稱取等質(zhì)量(0.01 g)的瘤塊并加到放有450μl組織裂解液的鑼蓋管中。使用羅氏組織勻漿儀6500 rpm，50s重復(fù)裂解2次。樣品室溫培育30 min。13000 rpm，2 min，吸取裂解勻漿350 μL加入到MPLC 2.0系統(tǒng)的樣本槽中。將樣本槽放到MPLC 2.0系統(tǒng)中，同時(shí)放置好洗脫槽、儲(chǔ)存槽、加工槽、吸頭站和反應(yīng)吸頭、廢物袋等。依據(jù)“RNA Tissue Fresh-Frozen”程序選擇樣本量為200μl并按要求加注試劑桶，一切就緒后運(yùn)行程序。

取5μl的各樣本RNA，用羅氏LC480完成cDNA合成反應(yīng)，按羅氏cDNA合成試劑盒說明依次添加Oligo(dT)18 1 μL，RNase free ddH2O 7 μL，混勻離心，65℃熱變性10 min，然后加Protector RNase Inhibitor 0.5 μL，Reverse Transcriptase Buffer 4 μL，Deoxynucleotide Mix 2 μL，Reverse Transcriptase 0.5 μL，混勻離心，55℃ 30min，85℃ 5min，37℃+∞。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測TNF-α基因的表達(dá)豐度 利用NCBI上ORF Finder找到小鼠TNF-α基因(GeneBank登錄號(hào)：BC137720)的翻譯區(qū)和非翻譯區(qū)，并使用在線軟件IDTDNA在其3’非翻譯區(qū)設(shè)計(jì)基因特異性引物(GSP引物)，內(nèi)參基因選擇β-Actin。上游GSP引物F：5’-GGGTGTTCATCCATTCTCTACC-3’；下游GSP引物R：5’-GTCCCAGCATCTTGTGTTTC-3’。內(nèi)參基因β-Actin-F：5’-GGCCGTGATCTCCTTCTG-3’；內(nèi)參基因β-Actin-R：GGGACCTGACCGACTACCT。反應(yīng)使用SYBR GREEN染料，在羅氏LC480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行。每個(gè)樣本三次實(shí)驗(yàn)學(xué)重復(fù)，反應(yīng)體系包括羅氏SYBR GREEN Master Mix 10μl，上下游引物各1μl，cDNA模板2μl，RNase-free ddH2O 6μl。反應(yīng)程序設(shè)置如下：95℃ 10min，然后95℃ 10s，60℃ 10s，72℃ 20s，50cycles。本研究使用相對(duì)定量方法，應(yīng)用2-ΔΔCt分析數(shù)據(jù)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，各組所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同組間的均值比較采用t檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05即兩組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，當(dāng)P<0.01則兩組有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠S180實(shí)體瘤瘤重和抑瘤率 黑參高劑量組瘤重、環(huán)磷酰胺組瘤重、紅參高劑量組瘤重與空白組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，抑瘤率方面也是這三組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠S180實(shí)體瘤瘤重和抑瘤率

注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.05

3.2 各組實(shí)體瘤TNF-α基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 如圖1為所有實(shí)驗(yàn)組實(shí)體瘤TNF-α基因和內(nèi)參β-Actin基因以Ct值為橫坐標(biāo)，以基因相對(duì)熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)的擴(kuò)增曲線。該曲線顯示目的基因和內(nèi)參基因的指數(shù)增長期和平臺(tái)期較為明顯，在15-35個(gè)循環(huán)數(shù)范圍內(nèi)可檢測到Ct值，擴(kuò)增曲線正常，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠，可用于相對(duì)定量分析。

圖1 實(shí)驗(yàn)組TNF-α基因和內(nèi)參β-Actin基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線，橫坐標(biāo)為Ct值，縱坐標(biāo)為基因相對(duì)熒光強(qiáng)度

不同實(shí)驗(yàn)組TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量的分析結(jié)果見圖2和表2。消癌平組、紅參低劑量組的TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量與空白對(duì)照組相比具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，黑參高劑量組具有顯著性差異(P<0.05)。

圖2 各實(shí)驗(yàn)組TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量(RQ)的柱形圖，縱坐標(biāo)為相對(duì)表達(dá)量，空白對(duì)照組RQ設(shè)置為1

表2 各組小鼠TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量(RQ)

分組相對(duì)表達(dá)量(RQ)分組相對(duì)表達(dá)量(RQ)空白對(duì)照組1 00±0 68紅參高劑量組0 69±0 23消癌平組3 38±0 61?黑參低劑量組0 38±0 58環(huán)磷酰胺組1 23±0 37黑參中劑量組0 82±0 48紅參低劑量組3 67±0 44?黑參高劑量組6 24±0 25??紅參中劑量組1 74±1 35

注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01

4 討論

人類社會(huì)迅猛發(fā)展隨著而來的是自然環(huán)境污染、人口老齡化和不良生活習(xí)慣的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致濁邪滋生和腫瘤化生。體內(nèi)腫瘤壞死因子TNF-α有能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗腫瘤等作用[7]，因此，未來我們可將TNF-α與黑參結(jié)合觀察抗腫瘤療效，為新藥研發(fā)提供基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)使用S180荷瘤小鼠作為動(dòng)物模型，TNF-α為檢測基因，對(duì)黑參抗腫瘤分子機(jī)制進(jìn)行研究。研究結(jié)果顯示，使用黑參和紅參對(duì)腫瘤重量都有抑制作用，以黑參高劑量組和紅參低劑量組抑制作用較好，且高劑量黑參組抑瘤率高于已上市中藥對(duì)照消癌平組，說明將黑參開發(fā)成抗腫瘤中藥或保健品具有廣闊前景。實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示，黑參高劑量組、紅參低劑量組和消癌平組同空白對(duì)照組相比TNF-α mRNA表達(dá)量上調(diào)，提示服用紅參和黑參均能上調(diào)小鼠TNF-α mRNA的表達(dá)豐度且黑參高劑量組更明顯，說明黑參可能通過上調(diào)TNF-α mRNA的表達(dá)豐度來發(fā)揮其抗腫瘤功效，而西藥對(duì)照環(huán)磷酰胺組可能通過其他途徑抑制腫瘤。

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Detection of the Effect ofBlackGinsengon TNF-α mRNA Presentation of S180 Tumor-bearing Mice by Real-Time Fluorescence Quantitative PCR

YUAN Yuan, HUANG He, GAN Yu, WANG Fei

(LiaoningInstituteofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110034,Liaoning)

Objective: To detect the effect ofBlackGinsengon TNF-α mRNA presentation of S180 tumor-bearing mice by real-time fluorescence quantitative PCR and analyze the tumor inhibition effect ofBlackGinsengby molecular biological method. Methods: Tumor-bearing mice models were made by armpit injection of S180tumor cells and were randomly divided into a control group, a cyclophosphamide group, aXiaoaipinggroup, high, medium and low dose groups ofRedGinsengand high, medium and low dose groups ofBlackGinseng. Except the control group, the other experimental groups were given intragatric administration. The mice weight in the pre-administration and the mice tumor weight in the post-administration were measured. Anti-tumor rate was calculated and IDTDNA primers were used. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect different TNF-α presentations. Results: Compared with the control group, the tumor mass in the experimental groups declined. Except theXiaoaipinggroup and the cyclophosphamide group, the high-doseBlackGinsenggroup and low and medium-doseRedGinsenggroups showed more obvious inhibition effect on tumor weight (P<0.01). Real-time PCR showed that when compared with the control group and other groups, the high-doseBlackGinsenggroup and the low doseRedGinsenggroup upregulated TNF-α presentation (P<0.01,P<0.05). Conclusion: The high-doseBlackGinsenggroup and the low-doseRedGinsenggroup can improve the TNF-α transcriptional presentation in mice and reduce tumor weight, among which the high-doseBlackGinsenggroup is more effective.

BlackGinseng, antitumor, real-time fluorescence quantitative PCR, TNF-α

遼寧省博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目：黑參抗腫瘤藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究(NO：20121135)< class="content">作者簡介：袁媛(1980-)，女，漢，博士后，副研究員，研究方向：生藥學(xué)，E-mail：yuanyuanvictory@163.com。

袁媛(1980-)，女，漢，博士后，副研究員，研究方向：生藥學(xué)，E-mail：yuanyuanvictory@163.com。

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1007-2349(2015)09-0055-03

2015-06-22)