實時熒光定量PCR檢測黑參對S180荷瘤小鼠TNF-αmRNA表達的影響*

袁 媛，黃 赫，甘 雨，王 菲

(遼寧省中醫藥研究院，遼寧 沈陽 110034)

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實時熒光定量PCR檢測黑參對S180荷瘤小鼠TNF-αmRNA表達的影響*

袁 媛，黃 赫，甘 雨，王 菲

(遼寧省中醫藥研究院，遼寧 沈陽 110034)

目的 實時熒光定量PCR檢測黑參對S180腫瘤模型小鼠TNF-αmRNA表達的影響，應用分子生物學手段分析黑參抑制腫瘤的機制。方法 采取腋下注射S180腫瘤細胞制得小鼠腫瘤模型，隨機分成空白對照組、環磷酰胺組、消癌平組、紅參高劑量組、紅參中劑量組、紅參低劑量組、黑參高劑量組、黑參中劑量組和黑參低劑量組。除空白對照組外，其他實驗組均采取同時灌胃給藥。測定小鼠給藥前后體重、給藥后瘤重，計算抑瘤率，利用IDTDNA設計引物，應用實時熒光定量PCR檢測不同組TNF-α表達豐度。結果 與空白對照組相比，所有實驗組腫瘤質量都有所減少。除消癌平和環磷酰胺外，使用高劑量黑參和低、中劑量紅參對腫瘤重量的抑制較為顯著(P<0.01)。實時熒光定量PCR顯示，同對照組及其他實驗組相比，高劑量黑參組和低劑量紅參組TNF-α表達量上調(P<0.01，P<0.05)。結論 綜上，使用高劑量黑參和低劑量紅參能夠提高小鼠TNF-α轉錄表達水平并減少腫瘤重量，其中高劑量黑參組效果更明顯。

黑參；抗腫瘤；熒光實時定量；TNF-α

人參(PanaxginsengC.A.Meyer)為五加科植物人參的干燥根，是亞洲常見藥材，具有很高的藥用價值和歷史文化價值，被譽為“草藥之王”，在科學研究領域和國際市場一直占有極其重要的地位，已經被傳統醫學乃至全世界廣泛應用。其性平，味甘、微苦，微溫，用于大補元氣、復脈固脫、補脾益肺、生津止渴、安神益智。現代臨床醫學和藥理學研究表明，人參具有提高機體免疫力、抗疲勞、抗腫瘤、降血糖以及抗炎等多種活性，因此在醫學及養生方面具有可觀的價值。近年來，各種各樣的人參炮制品作為功能食品用于飲食文化中，其中包括白參、紅參、黑參等。黑參是利用傳統的九蒸九曝炮制方法將人參反復蒸制烘干而得到的一種人參深加工品，是繼紅參后的又一新人參商品[1]。有文獻報道，黑參比白參和紅參有更強的抗腫瘤、抗炎、提高免疫力等生物活性。黑參具有很好的開發前景。

當人體受到某些外界不利因素影響，局部的細胞會發生失控性增殖而形成的新生物即腫瘤，常伴有腫塊。腫瘤有良性和惡性之分，良性腫瘤通常可通過手術切除，而惡性腫瘤往往會導致癌癥的發生。由于惡性腫瘤難以治療和較高的死亡率，已成為21世紀人類的第一大殺手。正是因為如此，新的有效的抗腫瘤藥物的研發勢在必行。黑參的炮制方法各不相同，但大多是將鮮人參經過多次蒸曬而成的外觀和化學成分發生改變的一類人參新炮制品。研究顯示黑參除了具有提高免疫力、對抗炎癥反應、防氧化、保護神經等功能，在抗腫瘤方面也發揮重要作用[2-5]。腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)由單核細胞和巨噬細胞分泌，對腫瘤細胞有抑制和殺傷的功效，可被用來研究腫瘤的發生、發展[6]。本研究利用實時熒光定量PCR檢測黑參對S180腫瘤模型小鼠TNF-α mRNA表達，從分子水平探討黑參抗腫瘤機制。

1 實驗材料

1.1 腫瘤細胞和實驗動物 S180腫瘤細胞購自上海；SPF級實驗小鼠90 只，(21±3)g，購自遼寧長生生物技術有限公司，許可證號：SCXK(遼)2010-0001。

1.2 實驗藥物 實驗所用黑參和紅參溶液為遼寧省中醫藥研究院科研制備。消癌平(南京圣和藥業有限公司，批號：201304241)，刮去糖衣研成粉末待用；環磷酰胺(通化茂祥制藥有限公司，批號：130201)，刮去糖衣研成粉末待用；紅參購自遼寧省中醫藥研究院中藥局；黑參按以往研究自制得到[2]。

1.3 實驗儀器 羅氏MPLC 2.0全自動核酸分離純化系統(德國羅氏公司)；羅氏LC480實時熒光定量PCR儀(德國羅氏公司)；羅氏組織勻漿儀(德國羅氏公司)。

1.4 實驗試劑 羅氏RNA純化試劑盒(組織用)貨號03330591001；羅氏反轉錄第一鏈cDNA合成試劑盒貨號04896866001；羅氏組織勻漿儀用鑼蓋管貨號03358941001、羅氏SYBR GREEN染料貨號04707516001；引物由本研究組設計，并由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

2 實驗方法

2.1 構建S180荷瘤小鼠模型和給藥 分組前稱重，將90只小鼠按體重分為9組，即正常對照組、環磷酰胺組、消癌平組、紅參低劑量組、紅參中劑量組、紅參高劑量組、黑參低劑量組、黑參中劑量組、黑參高劑量組。注射S180瘤株前外科手術器械高壓滅菌。S180瘤株經生理鹽水洗滌和活細胞計數后，在超凈工作臺中經小鼠腋下注射接種。正常對照組只構建腫瘤模型但不給藥，消癌平組和環磷酰胺組給藥量均為25 mg/kg(按成人每天服用量換算)，每天1次，連續10天。紅參低、中和高劑量組小鼠給藥量分別為13.6 g/kg生藥量、27.2 g/kg生藥量和40.8 g/kg生藥量，每天1次，連續10天；黑參低、中和高劑量組小鼠給藥量分別為13.6 g/kg生藥量、27.2 g/kg生藥量和40.8 g/kg生藥量，每天1次，連續10天。

2.2 抑瘤率計算 小鼠給藥第10天，禁食不禁水，第11天稱量體重，用頸椎脫臼法處死小鼠，打開胸腔，完整剝離腋下腫瘤塊、稱取瘤塊重量、拍照后將其凍存于-80℃冰箱待檢。根據稱得的重量，計算抑瘤率(inhibitory rate，IR)。計算公式為IR=(1-實驗組平均瘤重/對照組平均瘤重×100%。

2.4 提取瘤塊總RNA及cDNA的獲得 首先啟動全自動核酸分離純化系統，進行自動涂油脂(每次實驗前)和漏液檢測(每個月一次)。檢查無故障后，選取小鼠新鮮瘤塊組織，每組選3個，在電子天平上分別稱取等質量(0.01 g)的瘤塊并加到放有450μl組織裂解液的鑼蓋管中。使用羅氏組織勻漿儀6500 rpm，50s重復裂解2次。樣品室溫培育30 min。13000 rpm，2 min，吸取裂解勻漿350 μL加入到MPLC 2.0系統的樣本槽中。將樣本槽放到MPLC 2.0系統中，同時放置好洗脫槽、儲存槽、加工槽、吸頭站和反應吸頭、廢物袋等。依據“RNA Tissue Fresh-Frozen”程序選擇樣本量為200μl并按要求加注試劑桶，一切就緒后運行程序。

取5μl的各樣本RNA，用羅氏LC480完成cDNA合成反應，按羅氏cDNA合成試劑盒說明依次添加Oligo(dT)18 1 μL，RNase free ddH2O 7 μL，混勻離心，65℃熱變性10 min，然后加Protector RNase Inhibitor 0.5 μL，Reverse Transcriptase Buffer 4 μL，Deoxynucleotide Mix 2 μL，Reverse Transcriptase 0.5 μL，混勻離心，55℃ 30min，85℃ 5min，37℃+∞。

2.5 實時熒光定量PCR檢測TNF-α基因的表達豐度 利用NCBI上ORF Finder找到小鼠TNF-α基因(GeneBank登錄號：BC137720)的翻譯區和非翻譯區，并使用在線軟件IDTDNA在其3’非翻譯區設計基因特異性引物(GSP引物)，內參基因選擇β-Actin。上游GSP引物F：5’-GGGTGTTCATCCATTCTCTACC-3’；下游GSP引物R：5’-GTCCCAGCATCTTGTGTTTC-3’。內參基因β-Actin-F：5’-GGCCGTGATCTCCTTCTG-3’；內參基因β-Actin-R：GGGACCTGACCGACTACCT。反應使用SYBR GREEN染料，在羅氏LC480實時熒光定量PCR儀上進行。每個樣本三次實驗學重復，反應體系包括羅氏SYBR GREEN Master Mix 10μl，上下游引物各1μl，cDNA模板2μl，RNase-free ddH2O 6μl。反應程序設置如下：95℃ 10min，然后95℃ 10s，60℃ 10s，72℃ 20s，50cycles。本研究使用相對定量方法，應用2-ΔΔCt分析數據。

2.6 統計學分析 利用SPSS 17.0統計軟件處理數據，各組所得數據以平均值±標準差表示，不同組間的均值比較采用t檢驗，當P<0.05即兩組的差異有統計學意義，當P<0.01則兩組有顯著性差異。

3 結果

3.1 各組小鼠S180實體瘤瘤重和抑瘤率 黑參高劑量組瘤重、環磷酰胺組瘤重、紅參高劑量組瘤重與空白組相比有統計學意義(P<0.05)，抑瘤率方面也是這三組有統計學意義(P<0.05)，結果見表1。

表1 各組小鼠S180實體瘤瘤重和抑瘤率

注：與空白對照組相比，*P<0.05

3.2 各組實體瘤TNF-α基因的實時熒光定量PCR檢測 如圖1為所有實驗組實體瘤TNF-α基因和內參β-Actin基因以Ct值為橫坐標，以基因相對熒光強度為縱坐標的擴增曲線。該曲線顯示目的基因和內參基因的指數增長期和平臺期較為明顯，在15-35個循環數范圍內可檢測到Ct值，擴增曲線正常，實驗數據可靠，可用于相對定量分析。

圖1 實驗組TNF-α基因和內參β-Actin基因實時熒光定量PCR的擴增曲線，橫坐標為Ct值，縱坐標為基因相對熒光強度

不同實驗組TNF-α mRNA相對表達量的分析結果見圖2和表2。消癌平組、紅參低劑量組的TNF-α mRNA相對表達量與空白對照組相比具統計學意義(P<0.05)，黑參高劑量組具有顯著性差異(P<0.05)。

圖2 各實驗組TNF-α mRNA相對表達量(RQ)的柱形圖，縱坐標為相對表達量，空白對照組RQ設置為1

表2 各組小鼠TNF-α mRNA相對表達量(RQ)

分組相對表達量(RQ)分組相對表達量(RQ)空白對照組1 00±0 68紅參高劑量組0 69±0 23消癌平組3 38±0 61?黑參低劑量組0 38±0 58環磷酰胺組1 23±0 37黑參中劑量組0 82±0 48紅參低劑量組3 67±0 44?黑參高劑量組6 24±0 25??紅參中劑量組1 74±1 35

注：與空白對照組相比，*P<0.05，**P<0.01

4 討論

人類社會迅猛發展隨著而來的是自然環境污染、人口老齡化和不良生活習慣的產生，進而導致濁邪滋生和腫瘤化生。體內腫瘤壞死因子TNF-α有能夠增強機體免疫功能、抗腫瘤等作用[7]，因此，未來我們可將TNF-α與黑參結合觀察抗腫瘤療效，為新藥研發提供基礎。

本實驗使用S180荷瘤小鼠作為動物模型，TNF-α為檢測基因，對黑參抗腫瘤分子機制進行研究。研究結果顯示，使用黑參和紅參對腫瘤重量都有抑制作用，以黑參高劑量組和紅參低劑量組抑制作用較好，且高劑量黑參組抑瘤率高于已上市中藥對照消癌平組，說明將黑參開發成抗腫瘤中藥或保健品具有廣闊前景。實時熒光定量PCR顯示，黑參高劑量組、紅參低劑量組和消癌平組同空白對照組相比TNF-α mRNA表達量上調，提示服用紅參和黑參均能上調小鼠TNF-α mRNA的表達豐度且黑參高劑量組更明顯，說明黑參可能通過上調TNF-α mRNA的表達豐度來發揮其抗腫瘤功效，而西藥對照環磷酰胺組可能通過其他途徑抑制腫瘤。

[1]袁媛，徐榮培.人參新炮制品—黑參的研究進展[J].中華中醫藥學刊，2013，31(11)：2379-2381.

[2]袁媛，于艷，徐榮培.HPLC法測定19個人參新炮制品—黑參樣品中的人參皂苷含量[J].遼寧中醫雜志，2013，40(10)：1993-1995.

[3]Seo YB.High value-added health food of black ginseng[M].Korea，2008：35-36.

[4]Kang KS，Kim HY，Pyo JS，et al.Increase in the free radical scavenging activity of ginseng by heat-processing[J].Biological and Pharmaceutical Bulletin，2006，29：750-754.

[5]Kim KT，Yoo KM，Lee JW，et al.Protective effect of steamed American ginseng on V79-4 cells induced by oxidative stress[J].Journal of Ethnopharmacology，2007b，111：443-450.

[6]丁凱宏.腫瘤壞死因子在腫瘤研究中的進展[J].吉林醫學，2012，33(4)：823-824.

[7]崔力方，郭曉靜，付麗.TNF-α與腫瘤發生發展關系的研究進展[J].中華乳腺病雜志(電子版)，2007，1(6)

Detection of the Effect ofBlackGinsengon TNF-α mRNA Presentation of S180 Tumor-bearing Mice by Real-Time Fluorescence Quantitative PCR

YUAN Yuan, HUANG He, GAN Yu, WANG Fei

(LiaoningInstituteofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110034,Liaoning)

Objective: To detect the effect ofBlackGinsengon TNF-α mRNA presentation of S180 tumor-bearing mice by real-time fluorescence quantitative PCR and analyze the tumor inhibition effect ofBlackGinsengby molecular biological method. Methods: Tumor-bearing mice models were made by armpit injection of S180tumor cells and were randomly divided into a control group, a cyclophosphamide group, aXiaoaipinggroup, high, medium and low dose groups ofRedGinsengand high, medium and low dose groups ofBlackGinseng. Except the control group, the other experimental groups were given intragatric administration. The mice weight in the pre-administration and the mice tumor weight in the post-administration were measured. Anti-tumor rate was calculated and IDTDNA primers were used. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect different TNF-α presentations. Results: Compared with the control group, the tumor mass in the experimental groups declined. Except theXiaoaipinggroup and the cyclophosphamide group, the high-doseBlackGinsenggroup and low and medium-doseRedGinsenggroups showed more obvious inhibition effect on tumor weight (P<0.01). Real-time PCR showed that when compared with the control group and other groups, the high-doseBlackGinsenggroup and the low doseRedGinsenggroup upregulated TNF-α presentation (P<0.01,P<0.05). Conclusion: The high-doseBlackGinsenggroup and the low-doseRedGinsenggroup can improve the TNF-α transcriptional presentation in mice and reduce tumor weight, among which the high-doseBlackGinsenggroup is more effective.

BlackGinseng, antitumor, real-time fluorescence quantitative PCR, TNF-α

遼寧省博士啟動基金項目：黑參抗腫瘤藥效物質基礎研究(NO：20121135)< class="content">作者簡介：袁媛(1980-)，女，漢，博士后，副研究員，研究方向：生藥學，E-mail：yuanyuanvictory@163.com。

袁媛(1980-)，女，漢，博士后，副研究員，研究方向：生藥學，E-mail：yuanyuanvictory@163.com。

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1007-2349(2015)09-0055-03

2015-06-22)