益腎養陰合劑對MRL/lpr小鼠狼瘡性腎炎的保護作用及部分機制研究*

吳 洋，張巍瓊，李東云，粟 榮，

(1.云南省中醫醫院，云南 昆明 650021；2.云南中醫學院，云南 昆明 650500)

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·實驗研究·

益腎養陰合劑對MRL/lpr小鼠狼瘡性腎炎的保護作用及部分機制研究*

吳 洋1，張巍瓊2，李東云2，粟 榮1，

(1.云南省中醫醫院，云南 昆明 650021；2.云南中醫學院，云南 昆明 650500)

目的 探討益腎養陰合劑對腎功、腎臟病理變化及對P-STAT3表達的影響，揭示其發揮療效的作用機制，為益腎養陰合劑治療狼瘡性腎炎(LN)提供理論依據。方法 兩種種系相同不同品種的50只小鼠隨機分5組：正常組C57BL/6J小鼠(0.9%生理鹽水)；MRL/1pr小鼠根據尿蛋白含量隨機分為4組：模型組、中藥組、中藥聯合激素組、激素組，連續給藥4周后觀察P-STAT3、尿蛋白含量、血肌酐、尿素氮及腎臟病理變化。結果 在給藥第一周，與模型組相比，尿蛋白含量在各治療組之間無明顯差異(P>0.05)。在第2、3、4周時，與模型組相比，各治療組的尿蛋白、血肌酐、尿素氮含量均有顯著下降(P<0.05)，中藥聯合激素組的尿蛋白含量最低(P<0.05)。給藥處理后，p-stat3的表達均呈下降趨勢，中藥組、激素組的p-stat3表達相比模型組有所減少(P<0.05)；中藥聯合激素組的降低情況最為顯著(P<0.05)。HE染色三個治療組腎組織局部輕度系膜細胞增生，腎小球炎癥細胞浸潤減少。結論 1.益腎養陰合劑能改善MRL/lpr小鼠的腎功能及腎臟病理，且聯合激素腎功能改善更明顯。2.下調磷酸化的STAT3的表達可能是益腎養陰合劑治療狼瘡性腎炎的作用靶點之一。

益腎養陰合劑；狼瘡性腎炎；MRL/lpr小鼠；P-STAT3；病理

系統性紅斑狼瘡(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)是一種累及多系統、多器官的具有多種自身抗體的免疫性疾病。SLE累及腎臟時稱為狼瘡性腎炎(Lupus Nephritis，LN)，是SLE最為常見和嚴重的表現，也是影響疾病預后和導致患者死亡的主要原因。SLE患者腎活檢顯示，腎臟受累者幾乎為100%，其中有臨床腎損害表現者，占45%～85%[1]。益腎養陰合劑是根據云南省中醫醫院風濕科常見病種優化診療方案制定的協定方藥，在臨床上運用多年，具有良好的療效。本課題旨在觀察益腎養陰合劑對MRL/lpr小鼠尿蛋白、血肌酐、尿素氮的影響及腎臟的病理變化，從組織、分子生物水平闡述益腎養陰合劑對腎臟的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 C57BL/6背景小鼠為正常組，MRL/lpr小鼠測量體重和尿蛋白以選取實驗組小鼠：體重(29±3)g，尿蛋白(110±5)mg/mL。隨機分為4組，分別為：模型組(給予0.9%生理鹽水)；中藥組(益腎養陰合劑)；中藥聯合激素組(益腎養陰合劑+醋酸潑尼松)；激素組(醋酸潑尼松)。

1.2 實驗藥物 益腎養陰合劑由云南省中醫醫院煎藥房統一煎煮。醋酸潑尼松片(重慶科瑞制藥(集團)有限公司，批號：H50020459)。

1.3 指標檢測及方法 用BCA蛋白測定盒檢測尿蛋白含量；比色法檢測 血肌酐、尿素氮測定；Western blot檢驗P-STAT3測定；HE染色觀察腎臟病理變化。

1.4 統計學方法 采用SPSS18.0軟件進行統計學分析，組間比較采用t檢驗，或單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組尿蛋白比較 見表1。

表1 各時間點各組小鼠的尿蛋白檢測結果

注：同一時間段不同組之間比較：△表示與正常組相比P<0.05；▽表示與模型組相比P<0.05；*表示與中藥組相比P<0.05；○表示與中藥聯合激素組相比P<0.05；●表示與激素組相比P<0.05

由表1及圖1可知：同一時間點，各組尿蛋白檢測情況，在給藥第一周后，與模型組相比，MRL/lpr小鼠的尿蛋白含量在各治療組之間無明顯差異(P>0.05)。在給藥第2周時，與模型組相比，各治療組的MRL/lpr小鼠尿蛋白含量均有顯著下降(P<0.05)，差異有顯著性意義。在給藥第3周時，與模型組相比，MRL/lpr小鼠各治療組的尿蛋白含量均有顯著降低(P<0.05)，差異有顯著性意義，但在中藥組、中藥聯合激素組以及激素組這三組間的尿蛋白含量無統計學意義(P>0.05)。在給藥第4周時，與模型組相比，各治療組的尿蛋白含量均有顯著降低(P<0.05)，其中中藥聯合激素組的尿蛋白含量降低最為顯著(與中藥組，p=0.000，P<0.05；與激素組，p=0.001，P<0.05)，而中藥組與激素組的尿蛋白含量相比無統計學意義(p=0.265，P>0.05)。

圖1 同時間點下不同組小鼠的尿蛋白檢測情況

(NS.表示生理鹽水；Trad.表示中藥益腎養陰合劑；com.表示中藥聯合激素；PA.表示激素醋酸潑尼松；w.表示week，周)

2.2 各組腎功能指標及P-STAT3的結果 見表2。

表2 給藥4周后，各組小鼠血清中血肌酐、尿素氮含量測定結果

注：△表示與正常組相比P<0.05；▽表示與模型組相比P<0.05；*表示與中藥組相比P<0.05；○表示與中藥聯合激素組相比P<0.05；●表示與激素組相比P<0.05

圖2 western blot法測定各組小鼠腎臟組織中p-STAT3表達情況結果圖

從表2可知：中藥聯合激素組的血Scr值下降最明顯(與中藥組，P<0.05；與激素組，P<0.05)。而中藥組和激素組的血肌酐含量無顯著差異(p=0.791，P>0.05)。各治療組的小鼠尿液中尿素氮含量均有顯著下降(P<0.05)，其中中藥聯合激素組的尿素氮含量降低最為明顯，另外，給藥4周后，中藥組的尿素氮含量比激素組更少(P<0.05)。

從表2和圖2可得知：在正常組小鼠腎臟組織中p-stat3蛋白的表達非常弱，而MRL/lpr小鼠腎臟組織中p-stat3表達增強(P<0.05)；經給藥處理后，p-stat3的表達均呈下降趨勢，中藥組的p-stat3表達相比模型組有所減少(P<0.05)；中藥聯合激素組的降低情況最為顯著(與中藥組，P<0.05；與激素組，P<0.05)，而激素組的p-stat3表達比中藥組的高(p=0.038，P<0.05)。

2.3 腎臟病理切片HE染色結果 光鏡下觀察到正常組小鼠腎臟結構完整，無增生和炎癥細胞浸潤；MRL/lpr小鼠模型組腎組織中系膜細胞、內皮細胞呈輕中度增生，伴有炎癥細胞浸潤，部分腎小球體積增大，腎間質有單核細胞浸潤，而三個給藥組腎臟病變均較對照組有所減輕，局部輕度系膜細胞增生，腎小球炎癥細胞浸潤減少。(見圖3)

圖3 MRL/lpr小鼠腎組織病理切片HE染色×200

(注：A：正常組，B：模型組，C：中藥組，D：中藥聯合激素組，E：激素組)

3 討論

狼瘡性腎炎當屬“陰陽毒、紅蝴蝶斑、日曬瘡、腎痹、陽毒發斑”等范疇。孟如教授認為狼瘡性腎炎的病因多與感受邪毒有關，熱毒為關鍵，熱毒傷陰而致陰虛火旺。在本病發展過程中多由肺、脾、腎三臟功能失調而內生瘀血、痰濁、濕熱、水濕等病理產物。瘀血始終貫穿狼瘡性腎炎的不同階段，在緩解期，熱毒已去，陰虛或氣陰兩虛為病機的主要方面[2]。益腎養陰合劑是根據本院風濕科常見病種優化診療方案制定的協定方藥，該方由黃芪生脈六味二至丸加減化裁而成，具有益氣固腎，養陰清熱之功效。

系統性紅斑狼瘡是一種綜合征，每個患者誘發疾病的因素和免疫系統缺陷都不盡相同。JAK-STAT信號通路參與細胞增殖、分化、凋亡、血管生成以及免疫調節等過程。近年研究發現[3]，JAK/STAT 通路與多種腎臟疾病中的足細胞、系膜細胞、腎小球血管內皮細胞、腎小管上皮細胞及間質炎癥相關細胞的病理改變密切相關。JAK-STAT信號通路在細胞因子的傳導過程中起重要的作用，調節機體的免疫功能及介導炎性反應等作用[4]。JAK / STAT 通路與炎癥發生發展密切相關，不僅可以控制自身下游炎癥相關基因的表達，還可以與其他多種炎癥信號通路[核因子 κB(NF-κB)和轉化生長因子 β(TGF-β)等通路]發生相互作用，在機體炎癥反應過程中起著極為重要的調節作用。最近研究發現[5]，TGF-β1在狼瘡性腎炎發病中起著免疫調節作用，P-STAT3表達減少，能抑制TGF-β1等細胞因子過度生成。P-STAT3是JAK-STAT信號通路的下游，STATs 家族能和DNA結合，且可和JAK等酪氨酸磷酸化信號通路偶聯，把細胞外信號與細胞基因表達調控結合起來發揮轉錄調控作用。Harada等[6]發現SLE患者T細胞中磷酸化STAT3的表達比正常對照明顯升高，減少STAT3能使SLET細胞向炎癥組織遷移。本實驗研究發現MRL/lpr小鼠腎臟組織中p-stat3表達增強，給藥處理后，p-stat3的表達均呈下降趨勢，中藥組、激素組的p-stat3表達相比模型組有所減少(P<0.05)；中藥聯合激素組的降低情況最為顯著(P<0.05)。三治療組均能降低血肌酐、尿素氮、尿蛋白含量，中藥聯合激素組優于其他2組(P<0.05)，給藥4周后，中藥組的尿素氮含量比激素組更少(P<0.05)，說明在降低尿素氮方面，中藥組的效果優于激素組。此外腎組織的HE染色發現，治療組的腎小球損傷較模型組減輕。綜上可知益腎養陰合劑能一定程度上起到保護腎臟的作用，中藥聯合激素對MRL/lpr小鼠腎臟保護作用更明顯。

本課題研究，證實益腎養陰合劑能抑制P-STAT3增加，并改善腎功能，對狼瘡性腎炎具有一定的治療作用，體現了中醫藥保護腎臟的藥理效應及其治療狼瘡性腎炎的較好療效，充分發展中醫藥的優勢，為治療狼瘡性腎炎提供新思路。

[1]王吉耀.內科學[M].第2版，北京：人民衛生出版社，2010：617.

[2]吉勤，魏敏.孟如教授治療狼瘡性腎炎的經驗[J].云南中醫中藥雜志，2005，26(3)：66.

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Study on the Protective Effect and Mechanism ofYishenYangyinMixtureon Lupus Nephritis of MRL/lpr Mice

WU Yang1， ZHANG Wei-qiong2, LI Dong-yun2, SU Rong1

(1.YunnanProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Kunming650021,Yunnan；2.YunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Kunming650500,Yunnan)

Objective: To study the effect ofYishenYangyinMixtureon renal function, renal pathological changes and P-STAT3 presentation and reveal its clinical mechanism in order to provide a theoretical basis for the treatment of lupus nephritis (LN). Methods: Two germ lines of different kinds of 50 mice were randomly divided into five groups. Normal C57BL/6J mice (0.9% saline) and MRL/1pr mice were randomly divided into four groups according to urinary protein content, a model group, a TCM group, a TCM combined hormone group and a hormone group and were administrated for 4 weeks to observe their P-STAT3, urine protein, serum creatinine, blood urea nitrogen and renal pathological changes. Results: In the 1st week administration, compared with the model group, the urine protein of each group was no significant difference (P>0.05). In the 2nd, 3rd and 4th week administration, compared with the model group, the urine protein, serum creatinine and urea nitrogen of each group significantly decreased (P<0.05), among which the urine protein of the TCM combined hormone group was lowest (P<0.05). After the administration, p-stat3 presentation showed a downward trend. The p-stat3 presentation of the TCM group and the hormone group decreased when compared with that of the model group (P<0.05). The p-stat3 of the TCM combined hormone group decreased most significantly (P< 0.05). HE staining of renal tissue of three treatment groups showed local mild mesangial cell proliferation and glomerular inflammatory cell infiltration reduction. Conclusions: A.YishenYangyinMixturecan improve the renal function and renal pathology of MRL/lpr mice, and improve more obviously when combined hormone. B. The reduced phosphorylation STAT3 may be one of the targets for the treatment of lupus nephritis.

YishenYangyinMixture, lupus nephritis, MRL/lpr mice, P-STAT3, pathology

國家中醫藥管理局十一五中醫痹病學重點學科。< class="content">作者簡介：吳洋(1962-)，女，主任醫師，碩士研究生導師，研究方向：主要從事中西醫結合風濕病的防治研究。
E-mail：451886900@qq.com

吳洋(1962-)，女，主任醫師，碩士研究生導師，研究方向：主要從事中西醫結合風濕病的防治研究。 E-mail：451886900@qq.com

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