堿蓬內生真菌JP3的分離、鑒定及促生作用研究

趙 穎, 于 飛, 郭明敏, 卜 寧

(沈陽師范大學 化學與生命科學學院, 沈陽 110034)

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堿蓬內生真菌JP3的分離、鑒定及促生作用研究

趙 穎, 于 飛, 郭明敏, 卜 寧

(沈陽師范大學 化學與生命科學學院, 沈陽 110034)

為研究鹽生堿蓬(Suaedaglauca)植物體內生菌及其產生的生物學活性物質對植物的促生長作用,利用組織分離法對堿蓬內生菌進行分離;用水培法測定堿蓬內生真菌對水稻幼苗株高、干重、葉綠素含量等生理指標的影響;對具有明顯促生活性的菌株根據形態、培養特征和18SrDNA測序分析進行分類鑒定。從健康堿蓬植株的根、莖、葉中分別分離出19株、70株和49株,共138株內生菌,其中細菌13株、真菌122株、放線菌3株;篩選出對水稻幼苗具明顯促生活性的真菌JP3,由該菌處理的水稻幼苗與對照相比其干重增加12.23%,株高增加15.6%(P<0.05),總葉綠素含量增加了13.2%;18SrDNA測序和比對結果顯示JP3屬Glomerellacingulata,相似性大于97%。研究表明:堿蓬植物內生菌具有豐富、多樣的特點,是產生促生物學活性物質的重要微生物資源,可為開發新的植物促生劑提供生物源物質。

堿蓬內生真菌; 分離; 鑒定; 促生作用

0 引 言

植物內生菌是一類重要的微生物資源,有關植物內生菌與植物間的互作影響及其機制的研究已越來越引起人們的關注[1-2]。有研究表明,感染內生菌的植株比未感染的植株往往具有生長速度更快、對逆境的抵抗能力更強、對病蟲害的抵抗力強,具有更強的生存競爭力[3]。微生物肥料具有肥效高、本身無毒、不污染環境且成本低等特點,是比較理想的替代品,因此,合理開發和利用微生物肥料,尤其是開發內生菌資源,是提高作物的產量和促進農業持續發展的重要途徑[4]。

土壤鹽堿化使植物葉綠素含量、凈光合速率以及水分利用效率等逐漸降低,是制約我國農作物產量的主要因素之一[5]。堿蓬(Suaeda salsa)是一種生長于鹽堿地和海濱沙灘的耐鹽性極強的鹽生植物,在我國分布廣泛,是當前生物改良鹽漬土的首選植物品種[6]。長期以來,由于受鹽漬化土壤是“生命禁區”思想的禁錮,對鹽漬化極端生態下的微生物尤其是處于該環境下的植物內生菌研究、開發與利用很少有人問津。本研究從遼寧省盤錦市紅海灘自然保護區的堿蓬植株中分離獲得了內生菌,并對其中的促生活性菌株進行了篩選鑒定,旨在為進一步研究及開發堿蓬內生菌資源提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物 鹽生堿蓬(Suaeda glauca bge),于10月份采于遼寧省盤錦市紅海灘濕地自然保護區。

1.1.2 供試水稻(Oryza sativa L.) 遼星1號,由沈陽農業大學水稻研究所提供。

1.2 方 法

1.2.1 堿蓬內生真菌的分離純化

采用組織塊法[7]對堿蓬內生真菌進行分離。 取新鮮、無蟲害的健康堿蓬組織用自來水洗凈, 并用無菌紙吸干水分, 切掉須根,切取主根、莖成1.0 cm長的小段, 葉保留完整,進行表面消毒處理[8]: 用無菌水沖洗3～4遍, 75%酒精浸泡1 min, 無菌水沖洗3～4次, 在用0.1%升汞浸泡5 min, 無菌水沖洗4～5次。 樣品用無菌吸水紙吸干后備用。 將待分離的組織用無菌手術刀切成0.5～1.0 cm大小, 置PDA平板上, 25 ℃培養箱中培養, 根據菌落形態挑取不同真菌然后進行純化并接種于PDA斜面培養基上, 4 ℃保存備用。 吸取50 μL最后一次洗滌水涂布在PDA平板上, 至于25 ℃培養箱中培養, 作為空白對照。

1.2.2 篩選

1.2.2.1 堿蓬內生菌對水稻幼苗生長的影響

實驗材料選取子粒飽滿整齊的水稻種子,于28 ℃恒溫箱浸種24 h后,于30 ℃時催芽24 h。取發芽的水稻種子,整齊的擺放在含紗網的塑料燒杯上,燒杯內裝滿Hoagland 營養液進行水培。于人工氣候箱(晝夜溫度28 ℃/26℃;光照16 h;80%相對濕度;光強3 000 lux)中培養4 d,生長過程中每天定時定量補充營養液。4 d后用培養9 d的內生真菌及發酵液30 mL處理水稻幼苗,各處理重復3次,對照則加30 mL的培養液。繼續培養5 d后從每盆隨機抽取幼苗10株,洗凈根系,用直尺測量其株高。80 ℃烘干至恒重,精確稱量水稻的干重,詳細記錄數值。

1.2.2.2 堿蓬內生菌對水稻幼苗葉綠素含量的影響

用丙酮乙醇混合液法提取葉綠素,將丙酮乙醇按1∶1比例配成混合浸提液,備用。稱取0.1 g葉片,切碎置于離心管中,加入5 mL混合液,置于暗處,于室溫條件下浸提24 h。用混合浸提液作空白調零,測645、670、663 nm處的吸光度。

1.2.3 堿蓬內生真菌JP3的鑒定

篩選出的的優勢菌種進行形態學及分子生物學鑒定。使用真菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA作為PCR模版。以18S-ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和18S-ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′為引物進行擴增。將測得的18SrDNA序列在GenBank中進行BLAST分析,構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 堿蓬內生菌分離純化

圖1 堿蓬組織塊(根)中分離的植物內生真菌

采用組織塊分離法從健康堿蓬植物的根、莖、葉中共分離到138株內生菌(圖1), 其中細菌13株、真菌122株、放線菌3株; 根、莖、葉中分別分離得到內生菌19株, 70株, 49株, 分別占內生菌總數的13.8%、50.7%和35.5%。 由此可知, 堿蓬組織中內生菌的分布有所差異, 莖中內生菌數量最多; 內生真菌在數量上占有較大的優勢, 內生細菌和內生放線菌相對較少。

2.2 促生活性內生真菌的篩選

2.2.1 堿蓬內生菌對水稻幼苗生長的影響

菌株及發酵液對水稻幼苗的促生作用見圖2,從122株內生真菌中篩選出3株對水稻幼苗的長勢有明顯促進作用的內生真菌:JP3、JP4和JP2。三株菌處理水稻幼苗后,水稻的高度明顯大于對照組CK。水稻幼苗在培養10 d后,測定各實驗組和對照組水稻幼苗的株高和干重(結果見表1)。由表1可知, JP3和JP4菌株發酵液處理的水稻幼苗干重與對照的差異顯著,提高幅度分別為12.23%及8.93%,而JP2菌株發酵液處理的水稻干重差異不顯著,提高幅度為7.84%;3種內生真菌處理的水稻株高與對照的差異顯著,提高幅度分別15.6%、14.2%和12.8%。

圖2 菌株及發酵液對水稻幼苗的促生作用

表1 3株堿蓬內生菌對水稻幼苗生長的影響

實驗組別株高/cm干重/gCK16．71±0．65c0．098±0．004bJP319．32±1．33b0．110±0．002aJP420．87±0．74a0．107±0．005aJP218．98±1．09b0．105±0．06ab

注:表中數值表示平均值±標準偏差,不同的字母代表不同的顯著性差異(Duncan-test,P<0.05)。

圖3 對水稻幼苗葉片葉綠素含量的影響(Duncan-test,P<0.05)

2.2.2 堿蓬內生菌對水稻幼苗葉片葉綠素含量的影響

由圖3可以看出, JP3、JP4和JP2處理的水稻葉片葉綠素a、葉綠素b含量及二者總含量(以鮮質量計)均有升高,葉綠素b及總葉綠素含量與不加菌處理的對照差異顯著,提高幅度分別為 23.1%、27.6%和24.3%;13.2%、16.8%和14.5%,而葉綠素a差異不顯著,提高幅度分別為10.7%、12.9%和12.1%。發酵液處理后,葉綠素b的變化幅度及差異性明顯高于葉綠素 a,說明堿蓬內生菌對葉綠素a和b的影響有差異。

2.3 堿蓬內生真菌JP3的鑒定結果

形態學鑒定:內生菌的培養形態及顯微觀察結果如圖4所示。JP3在PDA培養基上平均生長速度約為6 mm·d-1。菌落初呈白色,后中心粉紅,外層為白色,菌落表面有黑色輻射狀溝紋,有紅色色素產生。菌落致密,基質反面黑紅色,菌落表面有透明液體狀滲出物,菌絲表面光滑。在光學顯微鏡下菌絲無色,分枝,有橫隔,自發地形成以特殊的菌絲變態形成的捕食器官收縮環。

(a)—Y11的菌落; (b)—Y11的菌絲形態(100×); (c)、(d)—Y 11的菌絲形態(400×)。

JP3菌株18SrDNA序列擴增和序列分析比對結果見表2, NCBI數據庫中與菌株JP3相似度較高的菌株均屬Glomerella sp.其中模式種Glomerella cingulata與菌株JP3的相似性達到了99%(圖5)。

表2 具促生活性的堿蓬內生真菌的18SrDNA比對結果

圖5 基于18SrDNA序列的JP3菌株的系統發育樹

3 討 論

目前,關于鹽地堿蓬植物內生菌的相關研究的報道很少。遼寧盤錦紅海灘堿蓬長期生長在高鹽的特殊環境中。本研究對鹽生堿蓬的內生菌進行了分離和鑒定,結果表明,盡管堿蓬體內鹽濃度很高,在一定程度上限制了內生菌的數量及種類,但在其體內仍然存在豐富的內生菌資源,本次研究先后共分離得到138株堿蓬內生菌,其中以莖中最多,其次為葉,而根中最少。這一特點與鈕旭光等[9]分離的堿蓬內生菌的數量分布為根內最多,其次是莖和葉片的分布規律不同,可能是由于不同地區、不同品種、不同分離時期所分離的內生菌數量不同。

堿蓬體內高鹽環境中的微生物與植物長期共同進化的過程中可能形成某些代謝機制或者產生某些代謝產物使植物能夠適應鹽堿的極端環境, 促進宿主生長, 現有的文獻在這方面已有報道, 涉及農作物、蔬菜及水果等各個領域[10-15]。 本試驗結果表明, 從堿蓬中分離得到的JP3菌株對水稻幼苗的生長有明顯的促進作用, 菌株發酵液處理組比對照組的水稻幼苗健壯、葉色濃綠、植株高、干物質的積累增加。

本研究對所分離得到的堿蓬內生菌進行了分離鑒定, 結果表明鹽生堿蓬體內存在豐富的內生菌資源, 但在篩選功能促生活性菌株所采用的方法比較繁雜,工作量大, 在研究中應找到更為有效和簡便的方法來對堿蓬內生菌資源進行挖掘和深入研究, 例如采用ACC為唯一的氮源快速篩選具有ACC脫氨酶活性的菌株[16]研究這類菌株的促生活性, 這將為內生菌對植物的促生機制方面提供新的思路。

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Isolation, identification and growth-promoting effect ofSuaedasalsaendophyte fungus JP3

ZHAOYing,YUFei,GUOMingmin,BUNing

(College of Chemistry and Life Science,Shenyang Normal University, Shenyang 110034,China)

Endophytes were isolated fromSuaedasalsaby tissue isolation to study the effects on promoting plant growth.Hydroponic experiments were carried out to study the role of endophyte fungi on rice seedling growth.Rice shoot height, dry weight and chlorophyll (Chl) content were determined.Strains were identificated according to endophytes morphology, characteristic and 18S rDNA sequencing results.138 endophytes were isolated from the roots (19 endophytes), stems (70 endophytes) and leaves (49 endophytes) ofSuaedaglauca, respectively, including 13 endophyte bacteria, 122 endophyte fungi and 3 endophyte actinomyces.Endophyte fungus JP3 which promoting rice seedling growth was screened.Shoot length, dry weight and chlorophyll (Chl) content of rice treated with endophyte fungus JP3 were significantly increased by 15.6%, 12.23% and 13.2%, respectively of the control.Endophyte fungus JP3 belonged toGlomerellacingulatafamily and had 97% similarity to otherGlomerellaspstrains according to 18S rDNA sequencing results.The results showed that endophytes isolated fromSuaedaglaucahad the traits of rich and diversity, which were the important microorganism resources and supplied biological source substances to exploit new plant growth promoting agent.

Suaedasalsaendophyte fungi; isolation; identification; promoting growth effect

2014-08-17。

國家自然科學基金資助項目(31270369); 沈陽師范大學實驗中心主任基金資助項目(SY201102)。

趙 穎(1989-),女,遼寧沈陽人,沈陽師范大學碩士研究生; 卜 寧(1960-),女,河北昌黎人,沈陽師范大學教授,碩士研究生導師。

1673-5862(2015)01-0116-05

Q949.714.2; Q949.32

A

10.3969/ j.issn.1673-5862.2015.01.026