花背蟾蜍皮膚結構及其抗氧化和免疫功能的研究

高鳳娟, 李丕鵬, 陸宇燕

(沈陽師范大學 兩棲爬行動物研究所, 沈陽 110034)

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花背蟾蜍皮膚結構及其抗氧化和免疫功能的研究

高鳳娟, 李丕鵬, 陸宇燕

(沈陽師范大學 兩棲爬行動物研究所, 沈陽 110034)

為了深入了解花背蟾蜍(Bufo raddei Strauch)皮膚顯微結構及其相關功能,利用石蠟切片及酶聯免疫吸附反應技術,觀察了花背蟾蜍背腹側皮膚及其皮膚腺的顯微結構特點,分別測定了背、腹側皮膚中SOD、CAT、MDA、TLR4和βD-1含量。結果:花背蟾蜍皮膚結構與其他兩棲類皮膚結構基本相同,其角質層腹側較背側厚,表皮和真皮背側較腹側厚;顆粒腺主要存在于背側,而黏液腺主要存在于腹側。SOD和TLR4含量腹側皮膚高于背側皮膚;CAT含量背側皮膚較腹側高;MDA和βD-1含量在背腹皮膚中相近。結論:花背蟾蜍皮膚結構和相關蛋白水平能夠較好的適應其生境,并具有一定的抗氧化能力和天然免疫功能。

花背蟾蜍; 皮膚; 顯微結構; SOD; TLR4;βD-1

0 引 言

脊椎動物的皮膚對機體有著重要的保護作用,而兩棲類由于一心室兩心房的特殊結構,皮膚在氣體交換中也承擔著不可忽視的作用。另外,近年的研究指出,兩棲類皮膚腺體可以分泌大量的抗菌肽[1-3],以防御外界微生物的侵入。雖然對兩棲類皮膚結構已有很多報道[4-7],但未見對東北地區花背蟾蜍皮膚結構、皮膚抗氧化酶和皮膚與天然免疫有關物質的研究報道。

花背蟾蜍是東北地區的廣布種,已經廣泛運用于生物學的研究[8-11]。國內對其皮膚的研究僅見對花背蟾蜍蝌蚪發生類壞死的皮膚在恢復過程中的超微結構、花背蟾蜍角膜和皮膚蛋白質組分的分析、花背蟾蜍耳后腺結構的研究和蝌蚪發育過程中皮膚的結構變化[12-15]。本研究旨在深入了解花背蟾蜍皮膚的結構、抗氧化和免疫功能的基本特點,為后續研究奠定基礎,并進一步豐富花背蟾蜍的生物學資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

成體花背蟾蜍5只,2014年5月采自沈陽北陵公園小湖,均為產卵后的個體,體重為(12±0.21) g,體長為(50±0.45) mm。實驗室條件下暫養10日左右,其間喂以面包蟲。

1.2 方 法

1.2.1 形態學

以適量的乙醚將實驗用花背蟾蜍麻醉后,在軀干前后肢間進行皮膚的環剝。環剝下來的皮膚放置在冰盒(培養皿中放置碎冰,在其上再放置潔凈的載玻片)上進行分類處理。

背腹近中線處左側各取3 cm×0.5 cm的皮膚固定于10%的中性福爾馬林溶液中,常規石蠟切片,厚7 μm,H.E染色和AB-PAS染色。利用OLYMPUS BX51-DP71顯微鏡進行顯微觀察和照相,Image-Pro Express 6.0進行相關參數的測量。

1.2.2 相關酶含量測定

完成上述取材后的剩余背、腹皮膚分別加入含有一定量的預冷任氏液(4 ℃)的離心管中剪碎,利用BD-1200非接觸式超聲波破碎儀(水循環制冷)進行破碎,利用TGL-16G-C型冷凍離心機離心(9 000 r/min)10 min取上清,保持于中科美菱超低溫冰柜(-86 ℃)冰凍備用。選用魚抗的酶聯免疫吸附試劑盒,利用TECAN infinite F50型酶標儀分別測定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)、TOll樣受體4(TLR4)、β-防御素1(βD-1)的含量。實驗所用試劑盒均購自北京鼎國試劑公司,嚴格按照說明書步驟操作。

1.2.3 計算公式與數據處理

參照李洋[16]計算腺體的數量密度方法計算花背蟾蜍背腹皮膚中腺體的數量密度,計算公式為:數量密度=腺體個數/(腺體平均直徑×材料平均長度)個/mm2。

所有實驗數據利用SPSS 22.0分析,符合正態分布的數據進行單因素方差分析,不符合正態分布的進行非參檢驗,描述性統計值用平均值±標準差表示。

2 結 果

2.1 顯微結構

花背蟾蜍皮膚的基本結構與其他兩棲類皮膚相似,可分為表皮層和真皮層。

2.1.1 表皮

在表皮細胞最外層是一層由死亡的角質細胞及其分泌物共同構成的角質膜,其表面光滑、厚薄均勻,H.E染色呈透明的淡紫色,與角質化細胞連接緊密,僅局部區域與角質化細胞脫離(圖1)。表皮呈為復層扁平上皮,最外層的角質化細胞呈梭形,H.E染色胞質呈伊紅色,胞核較小、梭形,深藍紫色。有些細胞已看不見其核的存在。

(a)—背側皮膚HE染色; (b)—腹側皮膚HE染色; (c)—背側皮膚AB-PAS反色; (d)—腹側皮膚AB-PAS染色。SC-角質層; TL-過渡層; SB—基底細胞; PC-色素層; SCp—致密層; SS—疏松層; MG—黏液腺; GG—顆粒腺。

表皮最內層的基底細胞呈長柱狀或橢圓形,排列整齊,H.E染色胞質呈淡藍紫色,胞核位于細胞中部,橢圓形,深染。在表皮的基底細胞和角質化細胞之間有1～3層的過渡細胞,此區域由內往外可見細胞呈橢圓形、扁橢圓形以及梭形的過渡變化。H.E染色中胞質也由淺藍色、淺紫色至尹紅色的過渡。胞核深染,由內向外細胞核逐漸變小,形狀由長橢圓形逐漸變成梭形,有些細胞核周呈空泡狀。在表皮中有色素顆粒分布,常見于背側皮膚基底細胞層上方區域,腹側皮膚少見。

2.1.2 真 皮

花背蟾蜍真皮疏松層的疏松結締較為稀薄,僅在腺體周圍清晰可見,H.E 呈淺粉色,AB-PAS染色呈藍色。疏松層近基底細胞基膜處和皮膚腺周圍分布有較多的毛細血管。黑色素細胞主要分布于表皮與真皮疏松層之間,且呈大小不均勻的連續的斑塊狀分布,在疏松層中偶爾也可見色素細胞的分布。背側皮膚色素層明顯較腹側密集。 真皮致密層由大量波浪狀平行排列的膠原纖維束構成,H.E染色呈淡紅色。在這些平行排列的膠原纖維中,每隔一定距離都有一些較細的纖維束垂直于皮膚表面分布,并為平行排列的膠原纖維提供附著。在膠原纖維間可見大量的成纖維細胞,細胞及胞核均呈梭形,胞質淡紅色,胞核深藍紫色。

表1 花背蟾蜍背腹側皮膚各層厚度及腺體密度

注:同一列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

由表1可見,花背蟾蜍背腹側皮膚各層之間均具有明顯的差異。背側皮膚最表層的角質層厚是腹側的89.23%,二者之間成顯著性差異。背側真皮疏松層厚為腹側的94.87%,二者間無顯著性差異。背側表皮層厚是腹側的130.58%,二者間呈極顯著性差異,而背側表皮的基底細胞厚是腹側的148.28%,二者間也呈極顯著性差異。背側皮膚致密層的厚是腹側的158.17%,二者呈極顯著性差異。

2.1.3 腺體

皮膚腺體屬泡狀腺,腺泡分布于真皮疏松層中,可見明顯的導管部與表皮細胞相連。花背蟾蜍皮膚腺可區分為黏液腺和顆粒腺2種。一般情況下顆粒腺大于黏液腺。

黏液腺:腺泡近圓形,腺細胞多呈高柱狀,H.E染色胞質呈淡藍紫色,胞核柱狀、深染,位于細胞基底。可見類肌細胞和毛細血管分布于腺泡細胞外周。在AB-PAS染色中,個別黏液腺的腺細胞可區分出玫紅色、藍色或玫紅藍相間。

顆粒腺:腺泡呈橢圓形,腺泡腔中充滿大小不一的顆粒。H.E染色中,顆粒呈粉紅色;在AB-PAS染色中,顆粒呈異質性,較大的顆粒多呈淡紫紅色、較小顆粒多為淡藍色。個別顆粒淡染但其中可見深色的不規則核心結構。大多數腺細胞呈扁平狀,H.E染色胞質呈淡藍紫色,核呈圓形或橢圓形、深染,位于細胞基底部。類肌細胞及毛細血管分布于腺泡細胞外周。

由表1可見,2種腺體在背腹側皮膚中呈不均勻分布,顆粒腺主要分布于背側皮膚中,腹側皮膚顆粒腺較少。

2.2 相關物質含量的測定

背側、腹側皮膚中相關物質含量檢測結果見表2。在皮膚與抗氧化功能有關的3個參數中,丙二醛(MDA)的含量在背腹側皮膚中幾乎相等;背側皮膚中超氧化物歧化酶(SOD)含量是腹側皮膚的87.77%,且二者之間有極顯著性差異;而背側皮膚中過氧化氫酶(CAT)的含量卻是腹側的122.56%,二者間呈顯著性差異。花背蟾蜍背腹皮膚與其免疫功能有關的2個參數中,β-防御素在背、腹側皮膚中含量基本相等;而背側皮膚中TLR4含量僅為腹側的57.62%,二者間呈極顯著性差異。

表2 花背蟾蜍背腹側皮膚抗氧化酶、βD和TLR受體含量

注:同一列不同小字母表示差異顯著(P<0.05),不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

3 討 論

3.1 花背蟾蜍皮膚結構與生活環境的關系

兩棲類是脊椎動物完成從水到陸演化的一個重要環節,兩棲類皮膚的組織學結構特點也顯示了相應的特征:兩棲類皮膚裸露光滑,表皮有一定程度的角質化,可以起到防止體內水分流失的作用[17],同時豐富的皮膚腺使兩棲類體表保持濕潤,以保證皮膚具有一定的氣體交換功能[18-19]。花背蟾蜍皮膚明顯較其他蟾蜍類薄,甚至比屬于水棲類型的黑斑側褶蛙[16]的皮膚還要薄。這個結果是否與本實驗用花背蟾蜍均為剛完成產卵、還處于繁殖季節有關,還需要進行進一步的研究。

3.2 花背蟾蜍皮膚抗氧化能力

由于臭氧層的削弱,地面承受的紫外輻射明顯增強。紫外線中能抵達地球表面的主要成分是長波紫外線(UVA)和中波紫外線(UVB),由于二者物理性質的差異,對生物體的影響也具有明顯的差異。其中UVA雖然其本身能量很低,對細胞和生物大分子沒有直接的損傷效應,但其具有很強的穿透力,可以通過細胞所含有的內源性發色團的作用,誘導產生氧自由基。氧自由基對細胞膜中不飽和脂肪酸具有極強的氧化作用,使其產生丙二醛(MDA),其是細胞膜受氧化程度的標志物之一[20-21]。同時生物體的細胞中也存在著一套抗氧化內體系,能及時清除過多的氧自由基,以維護細胞的正常功能[10]。抗氧化酶系中的SOD在細胞中主要是清除活性氧自由基,使其形成H2O2后再由CAT進一步還原為H2O[22-23]。因此,檢測花背蟾蜍皮膚中MDA 、SOD、CAT的含量可以反映花背蟾蜍皮膚的抗氧自由基的能力。本研究結果顯示花背蟾蜍背腹側皮膚中MDA含量基本相同,提示經過實驗室暫養的花背蟾蜍背腹側皮膚細胞膜脂氧化程度基本相同。但SOD和CAT卻表現出背腹側的明顯差異,在背側皮膚中作用于氧自由基的SOD含量低于腹側,而作用于H2O2的CAT卻高于腹側。這是否是背腹側皮膚結構的差異以及與環境接觸的方式不同等原因導致腹側皮膚抗氧化酶的活性較背側高以防止氧自由基對細胞的破壞作用還有待于深入研究。

3.3 花背蟾蜍皮膚免疫能力

皮膚對于兩棲類來說不僅僅是體表的保護層,更重要的是還承擔著部分天然免疫的功能。皮膚中腺體的分泌物在保持體表濕潤有利于氣體交換和分泌大量的皮膚抗菌肽以保護兩棲類避免微生物的侵害發揮著極其重要的作用[24]。β-防御素是抗菌肽之一,廣泛存在于生物體直接和間接與外界接觸的位置,它可以直接攻擊侵入的微生物,還有趨化活性和免疫激活的功能。而β-防御素表達目前研究比較透徹的是經過NF-KB信號轉導通路進行誘導。此通道中關鍵的蛋白是作為膜整合蛋白的病原模式識別受體,Toll樣受體(TLRs)就是其中的一類[25-26]。本研究中花背蟾蜍TLR4的含量腹側皮膚遠高于背側,而2個部位的βD-1含量基本相同。揭示了花背蟾蜍腹側皮膚有著很強的免疫應激能力,這種應激能力的儲備可能與其運動方式有一定的聯系。由于蟾蜍類的肩帶是固胸型。因此,它們在運動中常常以爬行的方式進行,這樣就有很多機會與凸凹不平的地面接觸,從而也避免不了被微生物侵入。腹側皮膚中儲存有一定量的βD-1和可以誘導其表達的TLR就可以及時利用天然免疫功能防止機體的進一步被感染。

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Microstructure of toad (Buforaddei) andits antioxidant and immune function

GAOFengjuan,LIPipeng,LUYuyan

(Institute of herpetology, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China)

In order to understand the skin structure and function of the toad (Buforaddei), the conventional paraffin section technique and ELISA were adopted to observe the microstructural characteristics of its dorsal skin, ventral skin and skin glands; and determine the contents of SOD, CAT, MDA, TLR4 andβD-1 of the dorsal skin and ventral skin, respectively. The results show that the toad skin structures are similar to other amphibians. That is the ventral cuticle thicker than the dorsal, the dorsal epidermis and dermis thicker than the ventral, granular glands mainly in the dorsal skin, and mucous glands in the ventral skin. SOD and TLR4 examined in the ventral skin are higher than in the dorsal skin, CAT containing in the dorsal skin is higher than in the ventral skin, but MDA andβD-1 are similar in these two areas. In conclusion, the structures and related protein levels of the toad skin closely adapt to the living environment, and have the antioxidant capacities and natural immune functions.

Buforaddei; skin; structure; SOD; TLR4;βD-1

2015-04-07。

國家自然科學基金資助項目(30870276)。

高鳳娟(1990-),女(蒙古族),遼寧阜蒙縣人,沈陽師范大學碩士研究生; 通信作者: 陸宇燕(1962-),女,上海人,沈陽師范大學教授,碩士研究生導師。

1673-5862(2015)03-0324-05

Q246; Q136; Q954.539

A

10.3969/ j.issn.1673-5862.2015.03.002