骨代謝相關信號通路與抗骨質疏松新型藥物的研發

上海交通大學附屬第六人民醫院骨質疏松和骨病科&骨代謝病和遺傳研究室 章振林

章振林 上海交通大學附屬第六人民醫院骨質疏松和骨病科主任、骨代謝病和遺傳研究室主任，醫學博士、教授、主任醫師、博士研究生導師，兼任中華醫學會骨質疏松和骨礦鹽疾病分會副主任委員、上海醫學會骨質疏松專科分會主任委員。主要診治代謝病骨病，研究方向為代謝病骨病遺傳機制。以第一完成人獲得國家自然科學基金5項，發表SCI收錄論文60多篇。

引 言

原發性骨質疏松癥是常見疾病，罹患于絕經后婦女和老年男性，其最大危害是會引起脆性骨折。因此，對骨質疏松的治療目標是降低首次骨折或再次骨折的發生風險。目前抗骨質疏松藥物按機制可以分為抑制骨吸收和增加骨形成兩類藥物，抑制骨吸收代表藥物是雙膦酸鹽類，而促進骨形成代表藥物為甲狀旁腺素。最近已經成功研發出一批新型抗骨質疏松藥物，有些已經或者即將上市，我們對此充滿期待，這些藥物的研發成功正是源于罕見骨病致病基因的發現及對其機制的闡明。本文將少見骨病致病基因及其相關信號通路進行闡述，主要涉及OPG/RNKL/RANK、WNT Wnt/β-catenin和組織蛋白酶K信號通路，及與之相關的抗骨質疏松新型藥物。

OPG/RNKL/RANK信號通路

該通路較早被學者們認識，不但涉及骨骼系統，而且對免疫、血液系統等均有重要作用。核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)受體活化素配體(receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL)與NF-κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor κB，RANK)結合后激活NF-κB，促進破骨細胞的生成、分化和成熟，而骨保護素(osteoprotegerin，OPG)可與RANKL結合，阻止RANK活化，抑制破骨細胞活性。如下一些少見或罕見遺傳性骨病致病基因均涉及該通路。

1. OPG基因突變

青少年性畸形性骨炎(juvenile Paget disease of bone)是常染色體隱性遺傳病，不同于經典型畸形性骨炎，前者在出生后或嬰幼兒時期即起病，由于破骨細胞功能增強，骨吸收顯著增加，導致骨溶解和疏松、骨骼彎曲畸形，同時常伴骨折、血堿性磷酸酶顯著增高。美國Whyte教授于2002年首先鑒定到致病基因OPG[1]。OPG基因突變后，OPG與RANKL結合功能丟失，而RANKL和RANK結合，促使破骨細胞過多活化，骨吸收大大增加。

2. RANK基因突變

該基因突變導致早發性畸形性骨炎(early onset Paget's disease of bone)，非常罕見，迄今僅有3個家族報告[2-4]，第一個家系是日本人。英國Ralston等[2]于2003年鑒定到RANK突變，呈常顯遺傳方式，該家系患者發病很早，10歲左右，表現為多骨骼受累，以骨溶解為特征，與其他類型畸形性骨炎區別還在于雙手指關節膨大、下頜骨膨大。我們2008年[3]報告一個漢族家系鑒定到RANK基因第一外顯子27bp重復突變，與上述家系不同之處是雙手指關節膨大出現得較晚，在38歲以后。該疾病需要與家族性膨脹性骨溶解(familial expansile osteolysis，FEO)鑒別，后者也呈常顯遺傳，但主要累及長骨，表現為顯著骨膨大和骨溶解，由RANK突變第一外顯子18bp重復突變引起[5]。RNAK信號肽區域重復突變，導致RANK活性顯著增加，致使破骨細胞功能增強，表現為骨吸收、骨溶解等。

3. RANKL基因突變

RANKL基因純合突變導致的骨硬化癥伴低γ球蛋白血癥，屬于常染色體隱型遺傳性骨硬化癥。 Guerrini等[6]報告發病機制是破骨細胞功能低下、骨吸收下降，顯然與上述OPG或RANK基因突變導致破骨細胞功能增強的機制正好相反。

顯然，上述3個基因突變引起以破骨細胞活性顯著增加或者減低為特征的骨病，即以骨吸收增加為特征的畸形性骨炎、家族性膨脹性骨溶解和以骨吸收降低為特征的骨硬化癥，可見OPG/RANK/RANKL通路在破骨細胞活化中扮演了不可替代的作用。正是基于對上述罕見遺傳性骨病和致病基因的認識，才研發了RANKL單克隆抗體，即狄諾塞麥(Denosumab)，其與RANKL結合，阻止了RANK和RANKL結合，導致破骨細胞功能下降，抑制骨吸收，從而達到治療骨質疏松的目的。

已經完成的3年隨機對照試驗(FREEDOM)結果顯示[7]，Denosumab明顯降低絕經后骨質疏松患者新發影像學椎體骨折和髖部骨折的發生風險。隨后的FREEDOM延長試驗[8]對4550例絕經后婦女使用Denosumab治療5年后發現，骨轉換指標可維持在低水平、骨密度顯著增加(腰椎和全髖部骨密度分別增加14%和7%)以及骨折風險降低。為期8年的2期臨床試驗[9]結果顯示，腰椎和全髖部骨密度與基線時比較分別增加16.5%和6.8%，血清骨吸收指標beta-CTX下降達到65%。2013年LANCET報告了一組隨機對照試驗[10]，三組分別使用PTH 20μg/d，Denosumab 60mg/次、6月1次，另外一組為兩組藥物聯合應用。1年后結果顯示，聯合應用組腰椎、股骨頸和全髖部骨密度增加顯著高于其他單獨應用組，上述部位骨密度分別比基線時增加9.1%、4.2%和4.9%。本研究提示PTH聯合Denosumab治療取得的骨密度上升超過以往報道的其他治療。因此，聯合治療對于高骨折風險的骨質疏松患者是一個可以選擇的治療方案。在國內，由本人牽頭聯合十多家三甲醫院也對安進(Amgen)公司研發的Denosumab進行了Ⅲ期臨床試驗。

Wnt/β-catenin信號通路

Wnt信號系統對骨代謝具有重要作用的認識，源于對兩類遺傳性骨代謝病的分子機制的闡明，即2001年Cell雜志[11]報道的骨質疏松伴假性神經膠質瘤綜合征(osteoporosis pseudoglioma syndrome，OPPG)。該研究鑒定到低密度脂蛋白相關蛋白5(low density lipoprotein receptor-related protein 5，LRP5)純合突變為功能丟失之突變；隨后，兩個獨立研究[12,13]均發現高骨密度綜合征，也稱為常染色體顯性遺傳性骨硬化癥1型，致病基因也是LRP5，為功能增強性雜合突變。我們也曾報道1個漢族患病家系[14]。LRP5對Wnt/β-catenin信號通路具有負調節作用，不同突變呈現出骨形成下降或增加的表現。至此，確立了Wnt/β-catenin通路對骨代謝的重要地位。而幾乎相同時期，2001年發現硬化性骨病(bone dysplasia sclerosteosis)和Van Buchem病致病基因為硬骨素(SOST)基因[15,16]，該基因編碼蛋白為骨硬化素(sclerostin)。骨硬化素就是通過對Wnt/β-catenin信號通路的負調節作用降低骨形成，而功能丟失性突變，促使骨形成顯著增加，導致骨密度顯著增加，而骨折風險并沒有增加。正是基于上述疾病分子機制的闡明以及對骨硬化素促進骨形成作用的深入理解，最近國外大制藥公司研發了血清骨硬化素單克隆抗體(Romosozumab)，就目前臨床試驗結果來言，是非常有前景的絕經后婦女骨質疏松的治療藥物。2014年NEJM報告了一項隨機安慰劑對照研究[17]，該研究將419名55～85歲低骨量(腰椎或股骨頸或全髖BMD T值為-3.5～-2.0SD)絕經后婦女隨機分成8組，分別接受不同劑量Romosozumab、阿侖膦酸鈉、特立帕肽和安慰劑治療1年。結果顯示，所有Romosozumab組均顯著增加各部位骨密度，其中每3個月皮下注射210mg組增加腰椎BMD為11.3%、阿侖膦酸鈉組增加4.1%、特立帕肽(甲狀旁腺素)組增加7.1%、安慰對照組下降0.1%，同時Romosozumab組顯示出短暫地增加骨形成指標、持久地抑制骨吸收指標的優勢，同時沒有發現嚴重不良反應。顯然，Romosozumab升高骨密度的療效要高于骨吸收抑制劑——阿侖膦酸鈉和骨形成促進劑——特立帕肽。該藥物預計明年在中國開展Ⅲ期臨床試驗。

組織蛋白酶K通路

對于組織蛋白K(cathepsin K，CTSK)對骨代謝的影響源自致密性成骨不全(pycnodysostosis)，一種常染色體隱性遺傳病，表現為頭顱畸形(包括寬顱縫)、肢端骨質溶解以及全身性骨骼發生均勻性致密性骨硬化，可以伴有鎖骨發育不全，容易發生骨折。Maroteaux和Lamy于1962年首次報道該病，1996年Gelb等[18]鑒定到致病基因是CTSK，存在無義突變、錯義突變等，以致其編碼蛋白功能丟失。2013年我們在1例非近親婚配男性先證者鑒定到CTSK基因R122Q純合突變[19]。CTSK是破骨細胞中表達量最高、溶骨活性最強的一種半胱氨酸蛋白酶，對包括Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白等骨基質蛋白具有降解作用。因此，抑制破骨細胞內的CTSK，可以降低骨吸收、增加骨量。為此，美國默克公司、瑞士諾華公司和英國GSK公司相繼研發了選擇性CTSK拮抗劑，分別為Odanacatib、Relacatib和Balicatib。一項為期5年Odanacatib(ODN)對絕經后婦女骨量減少或骨質疏松影響的臨床試驗[20]顯示，接受5年ODN 10～50mg/周的受試者，腰椎和髖部BMD持續上升。13例接受ODN 50mg連續5年的受試者，平均腰椎BMD變化百分比(95%CI)為11.9%(7.2%～16.5%)，而前2年接受ODN 50mg而后3年改為安慰劑的受試者(14例)平均腰椎BMD變化百分比(95%CI)為0.4%(3.1%～2.3%)；在連續接受ODN的受試者中(10～50mg，26～29例)，在第5年與基線相比，骨吸收指標——尿Ⅰ型膠原氦基末端肽/肌酐比值和血清C末端肽的下降百分比的幾何均數達55%左右，而骨形成指標包括骨源性堿性磷酸酶(bonespecific alkaline phosphatase，BSAP)和1型前膠原氨基端肽(amino-terminal propeptide of type I procollagen，P1NP)則接近基線水平，無明顯變化。在前2年接受ODN治療(10～50mg)而后3年為安慰劑的受試者中(25例)，骨轉換指標與基線水平相似。主要不良反應是治療后3年處理組發生尿路感染顯著高于安慰劑組，至于特別關注的硬皮病與安慰劑組沒有差異。隨后發表的另外1項為期2年的隨機安慰劑對照臨床研究[21]，納入214例研究對象為45～85歲絕經3年以上婦女，腰椎、股骨頸、大轉子、全髖BMD在-1.5SD～-3.5SD之間，研究對象隨機服用odanacatib 50mg/周或安慰劑，同時每周服用維生素D35600IU和每日補充鈣劑1200mg。治療2年后，與基線時比較，腰椎和股骨頸BMD分別增加5.4%和3.8%，血CTX和P1NP分別下降54%和9.1%，同時兩組不良反應無明顯差異。從以上臨床試驗結果我們可以得出，選擇性CTSK拮抗劑具有顯著增加骨量、降低骨吸收的療效，且總體耐受性良好。

展望與挑戰

依據OPG/RNKL/RANK、Wnt/β-catenin和CTSK信號通路研發的抑制骨吸收或者促進骨形成的抗骨質疏松藥物，正是基于罕見或少見的遺傳性骨病的致病基因之發現，值得我們國內學者關注和學習。在臨床關注罕見疾病家系的收集及分子機制的研究，不但可以明確診斷罕見疾病，而且對常見疾病治療藥物的研發具有重大意義。

總 結

從目前的臨床研究結果來言，上述信號通路研發的抗骨質疏松新型藥物均具有良好的療效，部分藥物已經在中國開展臨床試驗。當然，這些藥物的遠期療效和潛在不良反應尚待觀察，而且確切的作用機制以及與其他抗骨質疏松藥物聯合應用之療效均需要證實。

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