比較不同方法對新疆部分地區家畜布魯氏病菌種鑒定

多里坤·努爾沙發 米吉提·莫合他爾汗 阿曼古力·馬木提

(新疆維吾爾自治區動物衛生監督所 新疆 烏魯木齊 830011)

布魯氏菌病是世界范圍內廣泛流行，尤其是對以畜牧業為主的發展中國家造成較大危害的重要人畜共患病［1］。傳統病原學方法在布魯氏菌病的診斷確診中是金標準、該方法以較高的特異性能夠鑒別不同種型的同時，還能確定疫區和傳染源，但與PCR 方法比較，前者在耗時、操作安全性、敏感性等方面有明顯差異。PCR 方法在布病病原學檢測領域中的成功利用，在一定程度上克服傳統方法的上述缺點的同時提高了布魯氏菌株種、屬性鑒定水平，而PCR 方法有抗原不穩定等缺點。為此我們設計運用細菌分離加分子生物學的病原學檢測方案，對我區部分地區的牛、羊布魯氏菌菌種進行鑒定，同時了解不同菌株在不同動物間是否存在菌種轉移情況，達到通過特異、敏感、安全、快速的檢測方法，確診菌株，實施科學預防措施為目標，開展了此次檢測鑒定工作，具體檢測鑒定結果回報如下。

1.材料與方法

1.1 檢測病料及有關數據

在新疆南北疆設3 個未布病疫苗免疫采樣點共收集病原學組織(牛、羊流產胎兒)病料263 份，其中羊流產胎兒223 份、牛流產胎兒40 份。流產胎兒所屬畜主、飼養家畜、孕畜、流產、布病免疫情況及家人身體狀況等數據信息以填表的方式記錄保存。

1.2 試驗材料

1.2.1 主要試劑

瓊脂粉;胰蛋白示(TRYPTOSE);布魯氏菌試管凝集試驗陽性、陰性血清由哈藥集團生物疫苗有限公司購置;VirB8 - PCR 試劑及AMOS -PCR 試劑由新疆畜牧科學院獸醫研究所提供。

1.2.2 儀器耗材

生物培養箱;玻璃干燥缸;PCR 儀;電泳儀;圖像分析儀;一次性培養皿;蠟燭;移液槍頭;微量加樣器等。

1.3 方法

1.3.1 布魯氏菌的分離培養

無菌取牛、羊流產胎兒，肝、脾、胃液等組織及胃內容，其中每份牛犢組織病料同時開展需氧和厭氧培養，而羔羊組織病料只進行需氧培養［2］，37℃培養7 天，觀察菌落生長情況。挑取可疑菌落、用布魯氏菌陽性、陰性血清進行凝集試驗，對在陽性血清中凝集的可疑菌株，進行進一步純化培養，對純化可疑菌株、采用分子生物學PCR 方法進行分析鑒定。本試驗是用PCR 鑒定試驗代替傳統布魯氏菌病細菌學分離鑒定方法中的生化鑒定試驗，即不開展硫化氫產生、染料抑菌、單項特異血清A、M 及粗糙R 血清凝集、噬菌體裂解試驗等生化試驗。

1.3.2 PCR 方法

取上述細菌學方法分離的可疑菌株，用布魯氏菌VirB8 -PCR 和AMOS-PCR 兩種方法不同的試劑按說明進行試驗。

2.結果

2.1 布魯氏菌可疑菌株的分離

細菌學分離方法共分離20 株可疑菌株，其中從羊流產胎兒中分離到11 個株菌，牛流產胎兒中檢出9 個株菌。

2.2 VirB8 - PCR 和AMOS-PCR 試驗結果

從上述20 株可疑菌中，VirB8 - PCR 方法檢出了19 株布魯氏菌(見圖1 部分菌)，但是該試劑不能鑒別該菌的種屬，AMOS -PCR 方法檢出16 株布魯氏菌(見圖2 部分菌)，同時該試劑能鑒別牛種和羊種布魯氏菌，其中9 株羊流產胎兒分離菌株均為羊種布魯氏菌，7 株牛分離菌株均為牛種布魯氏菌，羊種布魯氏菌感染率為3.4%、牛種布魯氏菌感染率為2.6%。檢測結果顯示不同畜間未發現布魯氏菌菌種轉移現象。細菌學方法及兩種PCR 方法鑒別結果的對比，詳見表1 和圖3。VirB8 - PCR 布魯氏菌均出現的擴增帶為716bp，AMOS -PCR 牛種、羊種布魯氏菌均出現的擴增帶分別為498bp 和731bp。

圖1 6 株分離可疑菌株

AMOS- PCR 擴增結果M:Marker.1:羊流產胎兒中分離可疑菌株:1#、2#、3#、4#、5#、6#、8#.牛流產胎兒中分離可疑菌株7#、9#.

表1 細菌學方法及兩種PCR 方法鑒別結果的對比表

圖3 細菌學方法及兩種PCR 方法鑒別結果的對比圖

3.討論分析

3.1 布魯氏菌病的病原學檢測在布病疫情判斷，成功實施有效防制措施等方面最可靠和重要方法之一。布魯氏菌病細菌學檢測方法雖然能從被檢病料中直接檢出致病菌，還能進行菌性鑒定和鑒別種、屬，但所需時間較長、比較繁瑣，條件苛刻，檢出陽性率較低［3］，生物安全性差，實驗人員需進行嚴格培訓才能操作，因此上述該方法在逐步退出檢測方法行列之中［4］。綜合上述因素，本實驗對細菌學方法進行簡化，用特異、敏感、相對安全、快速的［5］PCR 方法代替細菌學生化鑒定。兩種PCR 方法中VirB8 - PCR 方法較敏感，檢出率高，但只能鑒別布魯氏菌、不能種屬區分，而AMOS-PCR 方法檢出率低，顯示特異性高，且能鑒別種屬，所以AMOS-PCR 方法推廣運用的價值較高。

3.2 試驗鑒定確診此次引起該流產的病因是牛感染牛種和羊感染羊種布魯氏菌。三種試驗的出菌率方面;細菌學方法疑似布魯氏菌出菌率為7.6%，VirB8 - PCR 為7.2%，AMOS -PCR 為6.08%。AMOS -PCR方法，在出菌率方面比細菌學方法底1.52 百分點，比VirB8 - PCR 底0.4個百分點。細菌學方法與VirB8 - PCR 及AMOS-PCR 方法的符合率，分別為95%和80%。VirB8 - PCR 及AMOS -PCR 的特異性、比細菌分離方法分別高5 個百分點和20 各百分點，相對而言、特異性最高的是AMOS-PCR 其次是VirB8 - PCR 和分離方法、敏感性相反。對于AMOS -PCR方法未能檢出的4 株菌歸屬問題，在以后的工作繼續細菌學生化鑒定，并且與其它方法對比試驗后、給予評價。AMOS -PCR 方法雖然在特異、便利、安全及快速等方面高于其它兩種方法，但是敏感性需要進一步評價。布魯氏菌患病畜群及時進行全檢、檢出陽性畜按有關規定處理后，未感染家畜進行疫苗接種，是保護人類健康、減少經濟損失、在畜間最終根除該病的最有效的方法和必要措施之一［6］。

3.3 為了更好地了解我區家畜布病發病情況和制定有效預防措施，今后的檢測工作中，需進一步加大病原學檢測工作。開展有針對性的防疫工作的工作中，利用分子生物學方法對分離菌株的基因序列進行分析，準確掌握菌種特征，為各類預防措施的及時順利開展，提供科學數據。

［1］ Marta A，Almiron Norberto，Sanjuan.The Aggregation of Brucella abortus Occurs Under Microaerobic Conditions and Promotes Desiccation Tolerance and Biofilm Formation［J］，Open Microbiol J.2013，7:87-91..

［2］ 李長友，李明，馬世春等.動物布魯氏菌病防治指導手冊［M］.中國農業出版社出版，2012，第一版，第二章，弟一節.

［3］ 李堅，李鐵鋒，王艾琳.用PCR 方法對布魯氏菌進行篩查及分型鑒定的研究［J］.中國地方病防治雜志，2009，24(6):300.

［4］ 張芳，錢愛東.布魯氏菌診斷學研究進展［J］.吉林畜牧，2011，01，274(32):10.

［5］ 姜海，崔步云，AMOS-PCR 對布魯氏菌種型鑒定的應用［J］.中國人獸共患病學報，2009，(25):107.

［6］ XinghongYANG，Jerod A .SKYBERG，LingCAO.Progress in Brucella vaccine development［J］.Front Biol (Beijing).2013，8(1):60 -77.