云南漢族人群CTLA-4基因多態性與自身免疫性甲狀腺疾病的關系*

王毅鵬 彭葆坤 朱麗芹 翁曉春 王瑛 唐哲

自身免疫性甲狀腺疾病（autoimmune thyroid disease，AITD），包括彌漫性毒性甲狀腺腫（Graves disease，GD）和橋本氏甲狀腺炎（Hashimoto's thyroiditis，HT），是器官特異性自身免疫性疾病。其發病為多基因遺傳與復雜的環境因素共同作用的結果[1]。近年來有多項研究顯示細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4 （Cytotoxic T lymphocyteassociated Antigen 4，CTLA-4）在GD遺傳易感性中占有重要的地位[2-5]。CTLA-4又名CD152分子，是一種T細胞上的跨膜受體，在T細胞表面重要的協同刺激分子受體。免疫反應中T細胞活化有兩類信號是必需的，第一類是抗原肽-HLA復合物，由抗原呈遞細胞所呈遞和特殊的T細胞受體識別，然后將信號傳遞給T細胞。第二類就是協同刺激信號，由抗原呈遞細胞上的協調刺激分子與T細胞表面相應的受體結合而產生。如果缺乏此類信號，T細胞會出現活化障礙，處于無反應狀態甚至被誘導凋亡；反之若此類刺激過度則可能激活自身反應性T細胞，導致自身免疫疾病的發生。B7：CD28/CTLA-4為此過程中最重要的協同刺激途徑。CTLA-4與CD28共同享有B7分子配體，其中CD28識別B7-1和B7-2后為T細胞提供正性的共刺激信號，而CTLA-4與B7結合后則對T細胞活化起負調節作用[6]。

關于CTLA-4基因多態性與AITD的相關性，國內外各家報道不盡相同，為此，筆者對GD、HT患者的CTLA-4基因第1外顯子第17密碼子49位點A/G多態性進行研究，以深入探討關于CTLA-4與AITD的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院內分泌科就診并確診的GD及HT患者，其中有82例GD患者為GD組，男24例，女58例，平均年齡（28.4±7.0）歲；51例HT患者為HT組，男11例，女40例，平均年齡（28.7±4.3）歲。根據臨床表現、體格檢查、輔助檢查（甲狀腺功能測定和甲狀腺超聲）診斷。選取健康對照組80例，男30例，女50例，平均年齡（30.5±8.1）歲，均來自本院體檢中心，均無甲狀腺疾病及其他自身免疫病的家族史。三組在年齡、性別、飲酒和吸煙等方面比較差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。所有研究對象均為云南地區的漢族。

1.2 CTLA-4基因多態性測定

1.2.1 標本采集 使用乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）抗凝管，取受檢者空腹（禁食12 h后）靜脈血2 mL，-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2 DNA的提取 用AxyPrep血基因組DNA試劑盒從收集的血標本中提取基因組DNA，保存于-80 ℃冰箱中。

1.2.3 目的片段聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）由 上 海 生 物 工 程 有 限公司合成引物，引物序列為：上游引物：5'-GCTCTACTTCCTGAAGACCT-3'， 下 游 引 物：5'-AGTCTCACTCACCTTTGCAG_3'，擴增片段長度為162 bp。PCR反應體系：將保存的基因組DNA原液用DNA溶解液稀釋至5~10 ng/L。PCR反應體系為15 μL，10×Taq buffer擴增緩沖液1.5 μL；4種dNTP混合物0.3 μL（2.5 mM each）；上下游引物各 0.2 μL；模板 DNA 0.5 μL；Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.1 μL；MgCl2為1.2 μL；加雙蒸水11 μL。反應條件：95 ℃預變性 5 min， 然后按照 95 ℃變性 30 s， 67.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸 60 s，循環 20次；95 ℃變性 30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循環20次；最后72 ℃延伸 6 min。

1.2.4 限制性內切酶法檢測CTLA-4基因多態性 將PCR擴增產物用限制性內切酶Bbv1在37 ℃恒溫箱中消化24 h，之后用3%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切片段，若出現162 bp一條條帶，判定為AA純合基因型；若出現162、88 bp和74 bp三條條帶，判定為AG雜合基因型；若出現88、74 bp兩條條帶，判定為GG純合基因型。

1.3 統計學處理 經Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗檢驗各組基因頻率、等位基因的分布；數據的統計學分析使用SPSS 21.0統計學軟件進行，計量資料符合正態分布，以（±s）表示，比較采用t檢驗，計數資料的比較采用 X2檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CTLA-4基因第1外顯子第17密碼子49位點基因型及等位基因分布頻率比較 經Hardy-Weinberg平衡法檢驗各組基因頻率表明，實際值與根據Hardy-Weinberg定律計算而得的理論值間差異無統計學意義（ X2=0.13，P=0.72； X2=1.68，P=0.19； X2=2.11，P=0.15）。此3種基因型頻率均符合Hardy-Weinberg定律，等位基因的分布具群體代表性。

2.2 各組基因型及基因型分布頻率 GD組GG基因型的頻率及等位基因G的頻率明顯高于健康對照組（ X2=9.353，P=0.009； X2=7.548，P=0.006），見表 1。而HT組GG基因型的頻率及等位基因G的頻率與對照組比較差異無統計學意義（ X2=0.062，P=0.969； X2=0.046，P=0.830），見表 2。

表1 GD組和對照組基因型及等位基因分布頻率 頻次（%）

表2 HT組和對照組基因型及等位基因分布頻率 頻次（%）

3 討論

CTLA-4基因定位于2q31-33，包括有4個外顯子和3個內含子。CTLA-4基因第1外顯子第17密碼子49位點為目前公認的CTLA-4與GD相關的多態性位點之一，其余還有位于第一內含子+1822位C/T等位基因等[7-8]，位于啟動子-318位點T/C等位基因和位于第四外顯子3'非翻譯區的+642位（AT）n可變重復序列等[9-11]。

國內外關于CTLA-4基因CTLA-4基因第1外顯子第17密碼子49位點多態性與AITD的相關性的研究結論不盡相同，有研究發現兩者密切相關[2-3，12-13]，而Pastuszak等[14]研究則發現兩者并無相關性。王欒等[15]研究發現GD患者和HT患者CTLA-4基因第1外顯子的第17密碼子49位點G等位基因頻率均高于對照組。并且GD組和HT組按性別分層分析后發現該等位基因分布無性別差異。余綺玲等[16]對廣東地區漢族人群100例GD患者與100名健康人的CTLA-4基因G49基因多態性進行檢測，發現GD組GG基因型和G等位基因頻率較正常對照組顯著增高。解剖學研究，然而姚斌等[17]對廣東地區漢族人120例GD患者及123名正常人CTLA-4基因進行研究后得出了相反的結論，其A49G位點的基因型、等位基因頻率也沒有表現出差異。

康毓芝等[18]研究發現寧夏地區GD患者組與對照組之間CTLA-4基因SNP （49）A/G的基因型分布具有統計學差異，GD組患者GG基因型和G等位基因頻率明顯升高。王淑瓊等[19]研究發現GD患者的CTLA-4第1外顯子的A/G49位點GG基因型頻率及G等位基因頻率較正常對照組顯著增高提示CTLA-4基因可能是漢族人群中GD的易感候選基因。朱凌燕等[20]對江西地區漢族人群99例GD患者和107例健康對照者CTLA-4基因第1外顯子第49位點的基因型進行檢測。結果發現GD患者GG純合子為46.47%，對照組GG純合子GG純合子為21.50%，兩者之間有明顯的統計學差異。

不同地區和種族的結果可能是抽樣誤差造成的，也可能是種族差異造成的。本研究檢測了82例GD患者，51例HT患者和80例健康人外周血CTLA-4基因第1外顯子的第17密碼子49位點的基因型并行分析，結果顯示GD組GG基因型的頻率及等位基因G的頻率明顯高于健康對照組（ X2=9.353，P=0.009； X2=7.548，P=0.006），而HT組GG基因型的頻率及等位基因G的頻率與對照組比較差異無統計學意義（ X2=0.062，P=0.969； X2=0.046，P=0.830）。提示攜帶 CTLA-4基因第1外顯子第17密碼子49位點GG基因型的個體發生GD的風險明顯增加。本研究與國內多數學者的研究結果相一致。

探討CTLA-4基因多態性與GD發病風險增加相關的原因可能在于CTLA-4第1外顯子第17密碼子49位點的不同基因型影響到了CTLA-4蛋白的表達及功能，從而導致不同的個體自身免疫性疾病的易患性的差異。進一步查證該基因序列發現，CTLA-4第1外顯子第17密碼子49位點單核苷酸基因多態性可導致該位點蛋白質翻譯時出現蘇氨酸和丙氨酸的置換，而這種置換可能會出現CTLA-4蛋白表達減低和糖基化的效率降低的結果[12]，而且有研究發現該位點G等位基因的多態性可使甲狀腺抗體，甲狀腺球蛋白及甲狀腺過氧化物酶抗體滴度升高[13，21]。同時，它與其他多態性位點連鎖不平衡還可影響其mRNA的穩定性。也有研究顯示G等位基因能減少CTLA4的表達，增加自身反應性T細胞增殖，而AA基因型與GG基因型相比，刺激后在mRNA水平和蛋白水平都有更高的CTLA4 表達[2-3]。

本研究顯示，提示CTLA-4在此過程中起了重要的作用，然而要闡釋清楚CTLA-4在GD致病機制中究竟扮演何種角色，需要進一步對其基因連鎖、免疫、蛋白表達等方面進行更為深入的研究。

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