狼毒多糖對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞P-selectin表達(dá)的影響*

蔣麗艷 于智浦 宋波

轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤主要生物學(xué)特征之一，也是癌癥患者死亡及遠(yuǎn)期療效差的主要因素[1]，是一個(gè)多分子參與的極為復(fù)雜的過程[2]，細(xì)胞黏附為關(guān)鍵步驟之一，黏附過程涉及選擇素（selectin）、整合素（integrin）、鈣黏素（cadherin）等多種黏附分子[3]。P-選擇素是細(xì)胞黏附分子家族的重要成員之一，在介導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附起了非常重要的作用[4-5]。因此，抑制P-selectin表達(dá)可能是治療腫瘤轉(zhuǎn)移的有效方法[6]。

狼毒多糖（EFP-AW1）是本實(shí)驗(yàn)室從狼毒大戟根部新發(fā)現(xiàn)并提取的低分子多糖化合物[7]，課題組前期研究證明其能夠抑制人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H460與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs的黏附，本試驗(yàn)以TNF-α誘導(dǎo)HUVECs 建立內(nèi)皮細(xì)胞分泌P-selectin模型，研究狼毒多糖（EFP-AW1）對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞P-selectin表達(dá)的影響，探討EFP-AW1是否能夠通過降低P-selectin的表達(dá)而抑制腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 狼毒大戟購買于齊齊哈爾市藥材公司，EFP-AW1為本實(shí)驗(yàn)室從中藥狼毒大戟中新發(fā)現(xiàn)并分離提取的低分子多糖化合物[7]，分子量為10.830 Da；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs購于美國ATCC細(xì)胞庫；用于培養(yǎng)細(xì)胞的RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清（FCS）均為HyClone產(chǎn)品；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）購于R&D公司。FITC標(biāo)記的P-selectin鼠抗人單克隆抗體（BD公司）；Trizol（TaKaRa公司）；SYBR?ExScriptTMRT-PCR Kit（TaKaRa公司）；引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，補(bǔ)充100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，置于5%CO2，37 ℃飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞鋪滿瓶壁80%~90%傳代，取5~6代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，并將細(xì)胞分為五組，分別為空白對(duì)照組、TNF-α刺激組、EFP-AW1低劑量組、EFP-AW1中劑量組、EFP-AW1高劑量組。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別加入不同劑量EFP-AW1（5、10 μg/mL和20 μg/mL），作用48 h后，除空白對(duì)照組外均加入10 ng/mL TNF-α，37 ℃刺激2 h，收集細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EFP-AW1對(duì)HUVECs細(xì)胞P-selectin蛋白表達(dá)的影響 收集1×106個(gè)HUVECs細(xì)胞，PBS洗2次，加入FITC標(biāo)記的P-selectin鼠抗人單克隆抗體（CD62P）20 μL，4 ℃避光孵育30 min。PBS洗滌2次，加入PBS重懸細(xì)胞，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 RT-PCR 檢 測(cè) TNF-α 誘 導(dǎo) 的 HUVECs細(xì) 胞P-selectin mRNA表達(dá) 利用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。在20 μL RT反應(yīng)體系中，取各組細(xì)胞總RNA 1 μg為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以4 μL逆轉(zhuǎn)錄合成的單鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR循環(huán)。PCR反應(yīng)引物序列如下：P-selectin 正向引物：5'-CAA TCA CTT TTA GCC AAA TATC-3'；反向引物5'-TTA TAA TTC AGC AAC CTG AAC TG-3'；β-action上游為：5'-AAG GAT TCC TAT GTG GGC -3'，下游為5'-CAT CTC TTG CTC GAA CTC-3'[8]。按說明書設(shè)置PCR擴(kuò)增條件：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；57 ℃，30 s；共 40 個(gè)循環(huán)。ABI7300熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。采用相對(duì)定量法，根據(jù)下列公式按Ct值計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量：基因的相對(duì)表達(dá)量=2-△△Ct[注：△△Ct=（Ct目的基因-Ct對(duì)照基因）-（Ct內(nèi)參目的基因-Ct內(nèi)參對(duì)照基因）]

2 結(jié)果

2.1 EFP-AW1對(duì)活化HUVECs細(xì)胞表面P-selectin蛋白表達(dá)的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明（圖1），TNF-α刺激HUVECs后，HUVECs黏附分子P-selectin表達(dá)明顯上升（P<0.05），而EFP-AW1低、中、高劑量組對(duì)TNF-α刺激的HUVECs P-selectin表達(dá)的上升均具有抑制作用（P<0.05）。

2.2 EFP-AW1對(duì)活化HUVECs細(xì)胞P-selectin mRNA表達(dá)的影響 根據(jù) 2-△△Ct值，計(jì)算各組 P-selectin 相對(duì) mRNA 表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖2）：TNF-α 刺激組HUVECs P-selectin 2-△△Ct值顯著高于空白對(duì)照組（P<0.05），而EFP-AW1低、中、高劑量組2-△△Ct值與TNF-α 刺激組比較顯著降低（P<0.05），表明EFP-AW1能夠下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的HUVECs黏附分子P-selectin mRNA表達(dá)。

圖1 EFP-AW1對(duì)活化HUVECs P-selectin蛋白表達(dá)的影響*與TNF-α組比較，P<0.05

圖2 EFP-AW1對(duì)活化HUVECs P-selectin mRNA表達(dá)的影響*與TNF-α組比較，P<0.05

3 討論

腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間相互作用是造成腫瘤轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)[9-10]。在轉(zhuǎn)移過程中，多種黏附分子發(fā)揮重要作用。黏附分子以配體（Ligand）-受體（Receptor）相對(duì)應(yīng)的形式發(fā)揮作用，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間或細(xì)胞-基質(zhì)-細(xì)胞之間的黏附，參與腫瘤轉(zhuǎn)移等病理過程[11-12]。P-selectin是黏附分子家族的重要成員之一，Aigner等[13]報(bào)道腫瘤細(xì)胞能夠通過其表面的P-selectin糖蛋白配體黏附到內(nèi)皮細(xì)胞表面P-selectin上，從而介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的黏附作用。已證實(shí)P-selectin能夠和多種人類腫瘤細(xì)胞結(jié)合，如結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、惡性黑色素瘤、胃癌、舌鱗狀細(xì)胞癌等[14]。因此，抑制內(nèi)皮細(xì)胞P-selectin的表達(dá)是抗腫瘤轉(zhuǎn)移治療中的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

狼毒多糖（EFP-AW1）是本實(shí)驗(yàn)室從狼毒大戟根部新發(fā)現(xiàn)并提取的低分子多糖化合物[7]，課題組前期研究證明其能夠抑制人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H460與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs的黏附。靜止的內(nèi)皮細(xì)胞不表達(dá)或低表達(dá)P-selectin，當(dāng)其受到組胺、凝血酶、TNF-α及LPS等激活后，可使已儲(chǔ)存的P-selectin于數(shù)分鐘內(nèi)在細(xì)胞表面表達(dá)[15]。本試驗(yàn)以TNF-α誘導(dǎo)HUVECs建立內(nèi)皮細(xì)胞分泌P-selectin模型，研究狼毒多糖（EFP-AW1）對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞P-selectin表達(dá)的影響，探討EFP-AW1是否能夠通過降低P-selectin的表達(dá)而抑制腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。研究結(jié)果表明，低、中、高劑量的EFP-AW1均可從核酸和蛋白水平抑制TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)P-selectin（P<0.05），并具有一定的劑量依賴性。表明EFP-AW1可能通過降低內(nèi)皮細(xì)胞表面P-selectin的表達(dá)而抑制腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，從而具有一定的抗腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在價(jià)值。

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