結腸癌細胞株SW480中CD133+的分選及Bmi-1基因的表達*

毛海波 朱國棟 劉國龍 關明媚 李寶秀 翁成蔭 曹小飛 方喜生

結腸癌是臨床常見的大腸惡性腫瘤，現階段結腸癌的主要治療手段包括有手術治療和化療，但效果均難以令人滿意，結腸癌患者的長期生存率比較低下，大部分是因為腫瘤復發[1]。研究發現腫瘤復發可能與腫瘤內存在少量腫瘤干細胞相關。腫瘤干細胞具有無限增殖和自我更新的能力，在腫瘤的發生發展過程中具有決定性作用[2]。Bmi-1基因屬于多梳基因家族，在維持腫瘤干細胞的增殖中的作用非常重要[3]。本項目旨在研究 Bmi-1基因在結腸癌干細胞SW480的表達，初步探討其在成瘤過程中的作用和機制，希望能在結腸癌的治療方面提供新的靶點，從而為從干細胞的層面上根治結腸癌提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人結腸癌細胞株SW480購自中國科學院上海生命科學研究院細胞生物學研究所。高糖DMEM培養基、DMEM/F12培養基（invitrogen原裝）購自杭州沃森生物技術有限公司。CD133/2（293C3）-PE鼠抗人抗體、CD133同型抗體（鼠IgG1-PE），購自德國美天旎公司，BD FACSCalibur流式細胞儀，美國BD公司。胎牛血清和TrypLE，購自美國Gibco公司；

1.2 結腸癌細胞株SW480的培養與分離 用含10%胎牛血清的高糖型DMEM培養基對人結腸癌細胞株SW480進行培養，置于5% CO2、溫度37 ℃和飽和濕度的培養箱中培養，至細胞貼壁生長至80%~90%融合時，用0.02%EDTA混合液和0.25%胰蛋白酶進行消化傳代，等到細胞處于對數期、有良好生長狀態時用于實驗。

用TrypLE將處于對數生長期的細胞進行消化后，將TrypLE去掉，添加適量的PBS液吹打成單細胞懸液。接種于50 mL細胞培養瓶進行培養，在細胞培養24 h之后，將培養瓶中的細胞懸液移入離心管中并分成CD133同型抗體組和CD133抗體組。將每組細胞以100×g離心5 min，棄上清。CD133同型抗體組加入100 μL的CD133同型抗體稀釋液，CD133抗體組加入100 μL的CD133抗體稀釋液，靜置4 ℃冰箱，避光，孵育30 min。用200目篩網濾過標記好的細胞懸液，用流式細胞儀檢測并分選CD133+和CD133-細胞群。

1.3 CD133+細胞腫瘤干細胞樣生物學特性的鑒定

1.3.1 CD133+細胞體外成球能力檢測 用干細胞培養基培養分選獲得的CD133+和CD133-細胞亞群，對其體外連續成球能力進行觀測。

1.3.2 CD133+細胞體外誘導轉化實驗 收集細胞球，離心（100×g，5 min），棄上清，加入DMEM基礎培養基（5%胎牛血清、5%青霉素、5%鏈霉素）5 mL進行培養，對細胞生長情況進行觀察。

1.3.3 CD133+細胞體外增殖能力的檢測 用干細胞培養基將分選所得CD133+細胞組和CD133-細胞組配成單個細胞懸液，調細胞密度到1×107/L，隨后接種細胞至96孔板中，200 μL為一孔，12個復孔為一組。置培養板在CO2培養箱中，在溫度37℃、5% CO2條件下培養，每隔3天換液1次，分別用CCK-8比色法于第1、3、6、9、12、15天和18天時在酶標儀上測定每孔細胞的吸光度（A）值。步驟：每孔添加20 μL CCK-8溶液，繼續培養4 h后，在酶標儀上，選擇450 nm，測定每孔450 nm的A值，以空白組調零，將實驗結果記錄。橫軸為生長天數，縱軸為每組所得數據的均值，繪制細胞的生長曲線，依此將兩組細胞的增殖情況進行比較。

1.4 Real-time PCR檢測CD133+和CD133-細胞亞群中Bmi-1基因的表達量 細胞總RNA的抽提根據Trizol裂解液說明書進行。RNA純度及濃度的測定采用紫外分光光度儀。逆轉錄根據逆轉錄試劑盒說明進行。Real-time PCR反應采用Sybrgreen染料法、熒光實時PCR儀（Applied Biosystems公司）進行。內參照為β-actin。引物設計如下：5'-GCTGATGCTGCCAATGGCTCTAA-3'為 Bmi-1上 游引物，5'-TCATTCACCTCCTCCTTAGATTTC-3'為下游引物；5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'β-actin為上游引物，5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'為下游引物。PCR反應條件：95 ℃ 2 min預變性，之后每一步：變性95 ℃，30 s，退火延伸60 ℃，35 s，40個循環，檢測。

1.5 統計學處理 采用SPSS 12.0統計學軟件對所得數據進行分析，計量資料以（±s）表示，兩組間比較用獨立樣本t檢驗，多組間比較用單因素方差分析（one-way ANOVA），多組間兩兩比較用LSD，以上實驗均在同等條件下重復3次，最終結果取平均值，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SW480細胞中CD133+細胞和CD133-細胞的分選 通過流式細胞術富集SW480細胞中CD133+細胞，檢測到CD133+細胞及CD133-細胞的百分比分別為7.02%及92.98%。

2.2 CD133+和CD133-成球能力及其誘導分化情況 立即用無血清干細胞培養液把分選后的CD133+和CD133-細胞進行培養，CD133+細胞培養1~2 d時，細胞懸浮生長，呈透亮、圓形；培養4 d后，細胞懸浮漂移，呈典型的球形生長，數量顯著增多；伴隨時間的推移，形成的腫瘤細胞球數量繼續增加，體積增大，細胞密度增加。在干細胞培養基中，CD133-細胞不能形成細胞球。用TrypLE將懸浮細胞消化掉，離心洗滌，制成單細胞懸液，再用DMEM/F12培養基（含10%胎牛血清）進行培養，4 h后，細胞長成梭形狀，部分貼壁生長；24 h后細胞完全貼壁生長。上述結果表明，細胞球在無血清培養基中獲得后，可以在含血清的培養基中貼壁分化，能連續傳代。

2.3 CD133+和CD133-細胞的增殖能力 置分選出來的CD133+細胞和CD133-細胞于無血清培養基中，并且添加生長因子，比較它們的體外增殖能力。由圖1可見，從培養第3天開始，CD133+細胞增殖比較明顯，CD133+細胞數在第3~6天增長最為迅速，其生長曲線從第6天開始直至培養第15天仍不斷上升，從第15天到18天增長相對平緩，但整個生長周期內CD133+細胞數始終保持增長狀態，提示在體外CD133+細胞增殖能力較強。CD133-細胞方面，從培養第1到第3天，細胞生長最為迅速，與CD133+比較，生長速度基本一致，但數量較少，差異有統計學意義（P<0.05）。第3天開始至第12天，生長曲線較為平坦，提示細胞數幾乎沒有增長，第12天之后，曲線開始呈下趨勢降，細胞數量下降明顯，提示CD133-細胞與CD133+細胞比較，其在體外增殖能力明顯較弱。

2.4 RT-PCR檢測Bmi-1 mRNA在CD133+和CD133-細胞的表達 RT-PCR檢測結果顯示，Bmi-1 mRNA在SW480結腸癌細胞株中CD133+細胞的表達顯著高于CD133-細胞，差異有統計學意義（P<0.05），見圖2。

3 討論

既往觀點認為，腫瘤的每個細胞都具有形成克隆和無限增殖的能力，都是均一的，然而具體參與腫瘤的形成、復發的細胞卻是隨機的。通過對血液系統腫瘤的回顧性研究，Reya和Morrison等在2001年提出完整的腫瘤干細胞（Tumor/cancer Stem Cells，TSCs/CSCs）學說，認為腫瘤的主體是由無自我更新能力、具有一定分化特征的非干細胞樣細胞構成，而具有極強的增殖潛力、維持腫瘤生長，且可能與腫瘤的轉移、復發關系密切的具有干細胞特征的腫瘤細胞只占腫瘤的一小部分，被稱為TSCs[4]。此后，研究發現，腫瘤干細胞不僅存在于血液系統，而且存在于多種實體瘤中，如前列腺癌、胃癌、結腸癌、乳腺癌、腦腫瘤。腫瘤學領域具有劃時代意義的全新理論之一就是腫瘤干細胞學說，其為腫瘤形成機制的研究帶來新的思路，同時也為臨床腫瘤的診斷和治療帶來了曙光和希望。現階段鑒定腫瘤干細胞還不能從形態學上入手，而多采用功能學的方法，主要包括化療抵抗、分化潛能、自我更新能力、裸鼠體內成瘤等幾個主要生物學特征。腫瘤干細胞的分選方法主要包括：（1）利用側群細胞（side population cells，SP）分選；（2）利用腫瘤干細胞表面特異性標志進行分選。Haraguchi等[5]在2006，年從多種人結腸癌細胞系中利用流式細胞術分離出少量SP細胞，認為SP細胞具有干細胞的特征，推測其為結腸癌干細胞。孫嵐等[6]在2007年發現，CD133+細胞與CD133-細胞均從肝癌細胞系Huh-7細胞中分選出，兩者相比，CD133+細胞在體外有較高增殖潛能。O’Brien等[7]在結腸癌細胞中發現了所占比例很小的細胞表面標記為CD133+的細胞，其增殖能力很強，經過連續移植傳代后，仍能分裂增殖、分化，并能保持其異質性。而CD133-結腸癌細胞雖然占比例很大，但經移植后并不能夠導致結腸癌的發生。通過他們的研究，可以推斷出CD133+為結腸癌干細胞的細胞表面特異性標志。本研究也發現，結腸癌細胞系SW480細胞中，CD133+的細胞所占比例少于8%，而結腸癌細胞系SW480細胞中分選出的CD133+細胞與CD133-細胞相比，在體外的生長速度和增殖數量都有顯著差異，表明CD133+細胞有較高增殖潛能。

圖1 結腸癌細胞株SW480中CD133+和CD133-細胞的生長曲線

圖2 Bmi-1mRNA在CD133+和CD133-細胞的表達

Bmi-1（B-cell-specific moloney leukemia virus insert site 1）基因是一種原癌基因，屬于多梳基因（Polycomb group，PcG）家族，1991年在鼠淋巴瘤細胞中被發現。PcG家族作為在果蠅發育時維持同源異形基因穩定表現的重要因子，在干細胞的維持、胚胎發育和腫瘤發生中有著不可忽視的作用[8-9]。目前，關于Bmi-1基因在維持正常干細胞“干性”作用的研究已在人體多種組織中得到證實[10-12]，而在腫瘤干細胞中的作用研究，多見于白血病干細胞、乳腺癌干細胞、喉癌干細胞和肝癌干細胞等[13-14]。Bmi-1基因對其他消化道腫瘤干細胞生物學特性的作用尚待進一步研究發現。結腸癌研究方面，已有研究發現Bmi-1在正常結直腸組織中幾乎不表達，而在腫瘤組織中大量表達。賈雪峰等[15]研究發現Bmi-1基因表達與大腸癌浸潤深度、淋巴結轉移和TNM分期顯著相關，與正常大腸組織比較，大腸癌組織Bmi-1基因表達陽性率顯著升高，而Bmi-1基因表達陰性率明顯降低，認為Bmi-1基因的高表達可能與大腸癌的發生和發展有緊密聯系。本研究結果表明，結腸癌細胞株SW480中CD133+細胞的表達顯著高于CD133-細胞。因此筆者推測結腸癌中Bmi-1基因的高表達可能與結腸癌干細胞有較強增殖潛力、維持腫瘤生長有關。

綜上，以CD133為特異性表面標志是富集結腸癌干細胞的其中一種手段，盡管在結腸癌細胞株SW480中CD133+的細胞所占比例很小，但是其增殖能力很強。在CD133+細胞中，Bmi-1基因表達量顯著高于其在CD133-細胞的表達中，這可能參與了結腸癌的發生與發展。

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