UPLC-MS/MS法測定煙草中12種常用農藥殘留量

熊 巍，韶濟民，龐 夙，黃 玫，陶曉秋

UPLC-MS/MS法測定煙草中12種常用農藥殘留量

熊 巍，韶濟民，龐 夙，黃 玫，陶曉秋*

（四川省煙草質量監督檢測站，成都 640001）

為了實現煙草中常用農藥殘留量的快速篩查，建立了超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）快速分析煙草中12種農藥殘留量的方法，煙葉樣品采用乙腈提取、PSA凈化和UPLC-MS/MS分析測定。12種農藥在低、中、高（2、200、500 μg/kg）3個加標水平的回收率范圍為62.1%～126.3%，相對標準偏差（RSD）為0.6%～14.8%，檢出限為0.24～4.24 μg/kg。本方法具有針對性強，檢測時間短和靈敏度高的特點，能夠很好的應用于煙草中常用農藥殘留量的快速分析檢測。

液相色譜；串聯質譜；煙草；農藥殘留

煙草中農藥殘留量的控制是保證煙草制品吸食安全的重要手段，近年來倍受人們關注。目前，在煙草生長過程中施用的農藥種類主要有殺菌劑、殺蟲劑、除草劑和抑芽劑。煙草中常用的殺菌劑有霜霉威、多菌靈、惡霜靈、甲霜靈、稻瘟靈和甲基硫菌靈；常用的殺蟲劑有吡蟲啉和辛硫磷，除草劑有異丙甲草胺；二甲戊靈、仲丁靈和氟節胺為煙用抑芽劑。鑒于農藥殘留對卷煙吸食安全性的影響，國際煙草科學研究合作中心（Cooperation Centre for Scientific Research Relative to Tobacco，CORESTA）于2003年提出對煙草中的99種農藥指導性殘留限量，并于2013年將指標擴充到120種，以上12種農藥均被列入此名單。除多菌靈和辛硫磷外，其他10種農藥均被列入中國煙葉公司2013年度煙草推薦使用農藥名單，在各個煙區都有施用。由于這12種農藥的施用廣泛性和潛在的煙葉安全性，快速，準確的對其定量分析顯得較為重要。

煙葉農藥殘留量的分析方法主要有氣相色譜法（GC）［1］、氣相色譜-串聯質譜法（GC-MS/MS）［2-4］和液相色譜-質譜法（LC-MS/MS）［5-7］。2012年，楊飛等［8］利用LC-MS/MS同時檢測了煙草及煙草制品中6種殺菌劑，此方法選取基質分散固相萃取處理樣品。廖雅樺等［9］利用凝膠滲透色譜處理煙葉樣品，高效液相色譜-串聯質譜法測定了煙草中二甲戊靈、仲丁靈和馬來酰肼等抑芽劑殘留。陳曉水等［10］利用GC-MS/MS同時測定了煙草中的氟節胺等132種農藥殘留，此方法適合于有機磷、有機氯和菊酯類農藥的檢測。2011年，煙草行業制定一系列多農殘檢測標準，而這12種常用農藥分列于2個檢測標準，3種不同的檢測方法［11-12］，使得檢測過程較為復雜，繁瑣。煙草常施用低毒類農藥可能會超出指導限量，監測此類農藥殘留量尤為重要。

本研究針對煙草中常施用的12種農藥指標，利用超高效液相色譜-串聯質譜儀，同位素內標定量法，建立UPLC-MS/MS同時快速分析煙草中霜霉威、氟節胺等12種農藥殘留的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯質譜儀（Xevo TQ，美國Waters公司），配備電噴霧電離源；渦旋振蕩器（VtexMixer 230VeU，美國Labnet公司）；離心機（Sigma 3K15，德國Sigma公司），無農藥殘留煙葉樣品由CORESTA提供。

甲酸（HPLC級，濃度為49%～51%，德國Sigma公司）；乙腈（色譜純，美國Thermo-Fisher公司）；霜霉威、多菌靈、吡蟲啉、二甲戊靈、仲丁靈、惡霜靈、氟節胺、甲霜靈、異丙甲草胺、稻瘟靈、辛硫磷和甲基硫菌靈標準品來自于Labor Dr. Ehrenstorfer-Schafers（化學純度≥98.5%，Augsburg，德國），內標二甲戊靈-d5，多菌靈-d4來自于加拿大TRC（化學純度98%，同位素純度98.9%和99.2%，多倫多，加拿大），甲基硫菌靈-d6購自CDN Isotopes Inc.（化學純度98%，同位素純度99.9%，Quebec Canada）。試劑包和N-丙基乙二胺（PSA）購自安捷倫公司（美國），水為超純水。

1.2 標準溶液配制

用乙腈準確配置混合標準儲備液（氟節胺為20 μg/mL，其他為5 μg/mL）儲存于棕色玻璃瓶。用乙腈準確配置二甲戊靈-d5，（0.190 mg/mL），多菌靈-d4（0.099 mg/mL）和甲基硫菌靈-d6（0.099 mg/mL）氘帶內標標準儲備液。取一定量的各內標儲備液進行混合，用乙腈稀釋定容，制得混合內標標準儲備液（10 μg/mL）。所有儲備液都在-20 ℃冰箱保存，使用前將其恢復到室溫。

1.3 樣品的提取和凈化

樣品前處理方法主要參照已報道方法［11-13］，將500 g的煙葉樣品粉碎均勻（100目），準確稱取2 g煙末于50 mL離心管中，加入超純水10 mL，振蕩直至樣品充分浸潤，靜置10 min。向離心管中加入10 mL乙腈，200 μL混合內標（10 μg/mL），渦漩振蕩1 min（2000 r/min），0 ℃條件下保持10 min。然后向離心管中加入4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉，1 g檸檬酸鈉和0.5 g檸檬酸二氫鈉，漩渦混振蕩2 min（2000 r/min），離心10 min（4000 r/min）。

取1.0 mL上清液于1.5 mL離心管，加入150 mg無水硫酸鎂及25 mg PSA吸附劑，漩渦振蕩2 min（2000 r/min），然后離心2 min（6000 r/min）。吸取上清液過0.22 μm有機相濾膜，移取200 μL濾液，用超純水稀釋至1.0 mL，用于LC-MS/MS分析測定。

1.4 LC-MS/MS條件

色譜條件：Atiantis UPLC HSS T3（100 mm× 2.1 mm，1.8 m，美國Waters公司）；流動相A：0.1%甲酸水溶液（體積分數），流動相B：0.1%甲酸甲醇溶液；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量10 μL。梯度洗脫條件：0～2 min，90% A～50% A；2～2.4 min，50% A～30% A；2.4～4.0 min，30% A～20% A；4.0～6.0 min，20% A～5% A，6.0～9.8 min，5% A～5% A；9.8～10.0 min，5% A～90% A，10.0～12.0 min，90% A～90% A。

質譜條件：電噴霧離子源，噴霧電壓（IS）：2.6 kV；離子化溫度350 ℃；霧化氣流量：1000 L/Hr；錐孔氣（cone）流量50 L/Hr；碰撞氣流量為0.15 mL/min；碰撞氣為氬氣，其余氣體為氮氣；駐留時間為30 msec，正離子MRM模式采集，監測離子對及其相應的碰撞能量（CE）見表1。

表1 多反應監測模式下12種農藥及其氘代內標的部分質譜參數Table1 Parameters of mass spectrometry for 12 pesticide residues and the internal standards in multiple reaction monitoring mode

2 結 果

2.1 標準曲線和檢出限

本實驗空白烤煙基質配制標準曲線，分別移取混合標準儲備液（5 μg/mL，氟節胺20 μg/mL）0、20、50、100、200、500 μL于6個1.8 mL旋蓋色譜瓶中，每個色譜瓶移入20 μL混合氘代內標工作液（10 μg/mL），加入200 μL空白煙葉樣品萃取液，用乙腈定容至1 mL。各標準工作溶液的濃度分別為0、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5 μg/mL。對各標樣峰面積與內標的峰面積的比值（y）和其濃度（x）進行線性回歸分析，得到標準曲線，結果見表2。各種化合物線性關系良好（除甲基硫菌靈外，其他化合物的相關系數r2≥0.99），可以滿足定量分析的需要。以3倍信噪比確定方法的檢出限，詳見表2。混合標準品及加標樣品的總離子流色譜圖見圖1。

2.2 方法的回收率及重復性

在農藥殘留量較低的烤煙樣品中添加一定量的混合農藥標準溶液，然后提取、測定，計算回收率。本實驗選用20、200、500 μg/kg三種不同濃度的加標回收實驗來考察方法的準確度，高、中、低每個水平做5個平行，計算5次結果的平均值為62.1%～126.3%。方法的精密度以回收率的相對標準偏差（RSD）來評價，對同一樣品平行測定5次，12種農藥的RSD范圍為0.6%～14.8%，結果見表3。2.3 實際煙葉樣本檢測

測定了國內外19個煙葉樣品中的12種農藥殘留量，結果表明，部分樣品的仲丁靈，多菌靈，吡蟲啉，稻瘟靈，甲霜靈，二甲戊靈，甲基硫菌靈和氟節胺有檢出，其平均含量分別為0.329、0.518、0.146、0.130、0.077、0.419、0.558、0.201 mg/kg，其余農藥未檢出。所有樣品的農藥殘留量均未超出CORESTA于2008年發布的指導性殘留限量。

表2 12種農藥的線性范圍及檢出限Table2 Linear equations and detection limits of twelve pesticide residues

圖1 加標樣品的選擇離子流色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of a mixture of twelve pesticide residues ST and their corresponding IS in tobacco sample spiked with ST and IS.

3 討 論

3.1 質譜條件的優化

三重四級桿質譜的錐孔電壓和碰撞能（CE）對分析物的離子化過程有重要影響，采用與液相聯機優化相關的離子源參數。采用針泵注射（5 μL/min）對目標物單獨進樣，將12種農藥及3種內標（0.5 μg/mL）的標準溶液進行全掃，得到最大響應值的母離子，在子離子掃描（PI）模式下，調整CE找到該母離子對應的子離子，其中響應最高的錐孔電壓和碰撞能量見表1。本實驗比較了各分析物的單標和混標的信號強度及峰面積，單標和混標的響應值基本一致，表明這12種農藥及其氘代內標離子間的抑制作用很弱。

3.2 色譜條件的優化

選取UPLC HSS T3，UPLC BEH Shield RP18和Atlantis dC18等色譜柱優化色譜條件，通過優化流動相與梯度洗脫條件，最終選取UPLC HSS T3作為12種農藥的分析柱。為選擇適宜的流動相，在ESI+模式下考察不同流動相體系，結果顯示加入甲酸有助于部分農藥的正離子化。在超純水和甲醇中加入0.02%至0.5%的甲酸，在0.1%的添加量時響應最高，超過會出現基質抑制效應，當添加量為0.5%抑制效應較為明顯。因此，選取0.1%甲酸水和0.1%甲酸甲醇體系作為本實驗的流動相。選用了適當的梯度洗脫程序使得12種農藥完全分離，整個梯度洗脫時間為12 min（圖1）。

3.3 提取條件的選擇

本實驗分析的12種農藥在2011年的煙草行業農藥殘留分析的系列標準中分屬于兩個不同的部分［12-13］，煙草及煙草制品多農藥殘留檢測中采用的前處理中需要分散固相萃取和固相萃取凈化。由于儀器檢測靈敏度提高，使此方法只需要進行分散固相萃取后即可稀釋進樣檢測。煙葉樣品在經過乙腈萃取、PSA純化后對于屬于第三部分的農藥如氟節胺和仲丁靈也有較好的回收率。

表3 煙草中12種農藥的回收率和精密度 n=5Table3 Recovery of twelve pesticide residues in tobacco

3.4 基質和稀釋的影響

樣品基質的不同對農殘的離子化效率有明顯的影響，是分析結果準確性的重要影響因素。本實驗選取空白烤煙基質，分別稀釋0、2、5、10倍后加入一定量的混合標準品，與流動相加入標準品的色譜峰進行對比，分析各個化合物的基質效應和稀釋效應。通過優化得到稀釋倍數為5倍時可較好的降低基質效應又不會損失方法的靈敏度。

3.5 方法比較

本實驗只關注了煙草生長過程中常用的12種農藥，把分列于標準方法第一部分和標準方法第三部分（YC-T 405.3—2011）［12］的氟節胺，仲丁靈和二甲戊靈合并為一個方法檢測，且本方法的檢出限要顯著低于標準方法（表2），有利于煙草常用農藥殘留量的快速檢測。與標準方法（YC-T 405.1—2011）比［11］，本方法基于UPLC-MS/MS儀器，選取的色譜柱粒徑更細，在較短的分析時間內顯著提高了分離度，從而使得分析時間要明顯短于標準方法（45 min）。

4 結 論

本研究對煙草中常用的12種農藥的殘留量進行了同時快速分析，采用基質分散固相萃取處理煙葉樣品，氘代內標定量，UPLC-MS/MS分析檢測，總分析時間為12 min。該方法具有針對性強，檢測時間短和靈敏度高的特點，能夠很好的應用于煙草中常用農藥殘留量的快速分析檢測。

［1］ 石杰，楊靜，劉惠民，等. 超聲波提取-固相萃取凈化-氣相色譜法分析煙草中擬除蟲菊酯類農藥及氟節胺殘留［J］. 分析試驗室，2010（4）：22-24.

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［12］ 中國煙草總公司. YC-T 405.3—2011. 煙草及煙草制品多種農藥殘留量的測定 第3部分：氣相色譜質譜聯用及氣相色譜法［S］. 北京：中國標準出版社，2011.

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Determination of Twelve Common Pesticides Residues in Tobacco by Using Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

XIONG Wei， SHAO Jimin， PANG Su， HUANG Mei， TAO Xiaoqiu*
（Sichuan Tobacco Quality Supervision and Testing Station， Chengdu 640001， China）

In order to rapidly determine common pesticide residues in tobacco， a rapid method for determining twelve pesticides in tobacco using UPLC-MS/MS was developed. Samples were extracted by acetonitrile， cleaned up by dispersive solid-phase extraction and finally detected by UPLC-MS/MS. The results showed that the recoveries of twelve pesticides ranged from 62.1%-126.3% at the spiking levels of 20 μg/kg， 200 μg/kg and 500 μg/kg. The RSD ranged from 0.6%-14.8%， and the LOD was from 0.24 μg/kg to 4.24 μg/kg. For the superior sensitivity， targeted residues and shorter analysis time， this method was suitable for the rapid analysis of common pesticide residues in batches of tobacco samples.

liquid chromatography； tandem mass spectrometry； tobacco； pesticides residue

S572.01

1007-5119（2015）01-0005-05

10.13496/j.issn.1007-5119.2015.01.002

四川省煙草專賣局（公司）科技計劃項目（201301003）

熊 巍，男，碩士，助理工程師，主要從事煙草、土壤化學分析工作。E-mail：xiongwei199@aliyun.com *通信作者，E-mail：txq@sctobacco.com.cn

2014-08-07

2015-02-25