胃癌組織中CD44v6、MMP-9蛋白的表達(dá)

王水生,趙春臨，丁朝輝，徐化楠，葉延偉

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸外科 鄭州 450052

胃癌組織中CD44v6、MMP-9蛋白的表達(dá)

王水生,趙春臨#，丁朝輝，徐化楠，葉延偉

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸外科 鄭州 450052

#通信作者，男，1966年1月生，博士，主任醫(yī)師，副教授，研究方向：消化道腫瘤基礎(chǔ)與臨床，E-mail:zhaochunlin@zzu.edu.cn

胃腫瘤；CD44v6；MMP-9；浸潤轉(zhuǎn)移

胃癌是消化系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是引起患者死亡的主要原因，然而腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是個多步驟多基因參與的復(fù)雜過程，涉及細(xì)胞與細(xì)胞外間質(zhì)或與其他細(xì)胞的一系列相互作用。有研究[1-2]表明，黏附分子 CD44拼接變異體v6(CD44 splice variant v6，CD44v6)的過度表達(dá)及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)活性和表達(dá)的增強與胃癌浸潤、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。作者運用免疫組化SP雙染技術(shù)檢測CD44v6和MMP-9蛋白在60例原發(fā)性胃癌及60例正常胃黏膜組織中的表達(dá),探討其在胃癌浸潤、轉(zhuǎn)移中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2013年3月至2014年3月期間收治的胃癌根治手術(shù)患者60例，所有病例手術(shù)前均未曾接受過放化療、中醫(yī)及免疫治療。患者男32例，女28例；年齡42～75歲，<60歲29例，≥60歲31例；腫瘤直徑≥3 cm 18例，<3 cm 42例；浸潤深度：T0、16例，T231例，T3、423例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：N04例，N1、236例，N3、420例；TNM分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期29例，Ⅲ期25例。

1.2 取材及制片 所有標(biāo)本取材均在手術(shù)中標(biāo)本離體后30 min內(nèi)完成，每例手術(shù)標(biāo)本均取癌灶組織和癌旁正常胃組織各2塊，每塊300～500 mg，無菌生理鹽水沖洗，濾紙吸干后裝入無酶EP管并立即投入液氮中，隨后轉(zhuǎn)至-70 ℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 CD44v6和MMP-9蛋白的免疫組化SP雙染法檢測 所有標(biāo)本用甲醛固定，脫水，然后石蠟包埋，最后4 μm厚連續(xù)切片。實驗前加做抗體交叉實驗，未見交叉反應(yīng)。嚴(yán)格參照說明書染色，混合一抗(稀釋200倍使用)，孵育條件為4 ℃過夜，并高壓蒸汽修復(fù)，以pH 6.0檸檬酸緩沖液作為抗原修復(fù)液，混合二抗(稀釋100倍使用)。陰性對照使用PBS代替一抗染色，以公司提供的已知陽性片作為陽性對照。CD44v6單克隆抗體、MMP-9多克隆抗體及Polymer雙染試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4 結(jié)果判斷 CD44v6和MMP-9的陽性染色呈棕黃色及紅色顆粒或團(tuán)塊狀，CD44v6主要表達(dá)于細(xì)胞膜，少數(shù)可見于胞質(zhì);MMP-9主要在近膜胞質(zhì)中表達(dá)。由兩位病理醫(yī)師分別觀察，每張切片選取3個具有代表性的高倍視野(×400)，計數(shù)100個細(xì)胞，根據(jù)染色程度以及陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行評分。①染色程度:不著色為0分，著色淡為1分，中度著色為2分，著色深為3分。②陽性細(xì)胞百分比：<5%為0分， 5%～為1分， 25%～為2分，50%～為3分。兩者相乘為最后得分，0～1分為陰性(-)，2～3分為(+)，4～6分為()，>6分為()。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0分析。用配對χ2檢驗比較胃癌及癌旁正常胃組織中CD44v6 和MMP-9蛋白表達(dá)的差異，應(yīng)用χ2檢驗分析胃癌組織中CD44v6和MMP-9蛋白的表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系，應(yīng)用Spearman相關(guān)分析胃癌組織中兩種蛋白表達(dá)的關(guān)系，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織及癌旁正常胃組織中CD44v6與MMP-9蛋白的表達(dá) 胃癌組織中CD44v6主要定位于細(xì)胞膜和近膜的胞質(zhì)(圖1 )，呈異質(zhì)性表達(dá)，胃癌組織中CD44v6蛋白陽性表達(dá)率81.67%(49/60)，高于癌旁正常胃組織陽性表達(dá)率為15.00%(9/60) (表1)。MMP-9陽性表達(dá)產(chǎn)物在胃癌組織細(xì)胞中主要定位于細(xì)胞質(zhì)，在60例胃癌組織中陽性表達(dá)率為73.33%(44/60)，在癌旁正常胃組織中陽性表達(dá)率為5.00%(3/60)(表2)。胃癌組織中CD44v6和MMP-9蛋白陽性表達(dá)率均高于癌旁正常胃組織。

圖1 胃癌組織中CD44v6(A)和MMP-9(B)的表達(dá)(SP雙染, ×400)

表1 胃癌及癌旁正常胃組織中CD44v6蛋白的表達(dá) 例

表2 胃癌及癌旁正常胃組織中MMP-9蛋白的表達(dá) 例

2.2 胃癌組織中CD44v6與MMP-9蛋白的表達(dá)與胃癌患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 見表3。

表3 CD44v6與MMP-9蛋白的表達(dá)與胃癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 例(%)

2.3 胃癌組織中CD44v6與MMP-9蛋白表達(dá)的關(guān)系 胃癌組織中CD44v6與MMP-9蛋白的表達(dá)呈正關(guān)聯(lián)，見表4。

rS=0.036，P=0.009。

3 討論

惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是引起患者死亡的主要原因，然而腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是個多步驟多基因參與的復(fù)雜過程，其中細(xì)胞黏附、基質(zhì)溶解和細(xì)胞移動是癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移過程中的3個步驟[3]。

CD44是由單一基因編碼的單鏈膜表面糖蛋白家族，具有高度異質(zhì)性，基因定位于第11號染色體短臂上[4],CD44v6是CD44家族中的一種變異形，它能與透明質(zhì)酸結(jié)合，通過影響腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)的結(jié)合從而改變腫瘤細(xì)胞的浸潤及轉(zhuǎn)移能力。該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌組織中CD44v6蛋白的表達(dá)均高于正常胃組織;CD44v6在胃癌組織中的表達(dá)與胃癌浸潤深度及TNM分期密切相關(guān)，但與年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤的大小及生長位置無關(guān)。Okayama等[5]發(fā)現(xiàn)在胃腺癌組織中CD44v6陽性表達(dá)率明顯高于其在非典型增生胃黏膜及正常胃黏膜中的表達(dá)率，隨著腫瘤細(xì)胞浸潤深度的增加、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，CD44v6陽性表達(dá)率顯著升高，但與年齡、性別及有無脈管侵犯無關(guān)。CD44v6強陽性表達(dá)的胃癌患者術(shù)后生存率均明顯降低，表明胃癌CD44v6的過度表達(dá)可能使胃癌細(xì)胞產(chǎn)生侵襲表型，以利于癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[2]。該研究結(jié)果與以上結(jié)果基本相符，即胃癌的浸潤深度及TNM分期與CD44v6的表達(dá)有關(guān)，說明CD44v6確實在胃癌浸潤中扮演著重要的角色。

MMP-9是MMPs中的重要成員，能降解細(xì)胞外多種基質(zhì)成分，其中就包括基底膜的主要成分Ⅳ型膠原[6]。腫瘤細(xì)胞表達(dá)MMP-9與其侵襲轉(zhuǎn)移能力有關(guān)[7]。Littlepage等[8]報道MMP-9參與了腫瘤新生血管的生成，新生微血管在結(jié)構(gòu)上不完善，缺乏肌層，基膜不連續(xù)，這些結(jié)構(gòu)特點喪失了組織對腫瘤侵犯的屏障作用，增加了腫瘤進(jìn)入淋巴、血液循環(huán)的可能。有研究[9]表明MMP-9的表達(dá)和活性隨乳癌分級的增加而增高。對于胃癌既往研究[10]顯示，MMP-表達(dá)與胃癌浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病期密切相關(guān)，MMP-9強陽性表達(dá)者術(shù)后生存率顯著下降，提示MMP-9表達(dá)與胃癌的發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，而MMP-9強陽性表達(dá)常常意味著胃癌病期較晚[2]。以上結(jié)果一定程度上說明了MMP-9在胃癌惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮著重要的作用，其中在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面的結(jié)果與該實驗結(jié)果不完全一致。然而也有學(xué)者[11]表明MMPs在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中的作用尚無統(tǒng)一結(jié)論。該研究有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者M(jìn)MP-9蛋白的表達(dá)未見顯著差異，原因可能有：①無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的樣本量偏少。②胃癌特殊的“跳躍式”淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方式。

該研究結(jié)果顯示胃癌組織中CD44v6和MMP-9蛋白表達(dá)有關(guān)聯(lián)。以往有研究[12]表明CD44v6有利于MMP-9錨定在細(xì)胞膜表面，通過影響細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白的構(gòu)型和分布從而介導(dǎo)腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移。該研究結(jié)果與以上理論相符，可以推斷出CD44v6與MMP-9在胃癌浸潤轉(zhuǎn)移過程中相互關(guān)聯(lián)、協(xié)同作用。因此，聯(lián)合檢測兩者對胃癌治療的臨床實踐具有一定的指導(dǎo)意義，即對兩者表達(dá)均陽性的患者應(yīng)采取更積極的治療措施。

[1]張成武,徐文娟,趙仲生,等.CD44V-6和E-CD的表達(dá)與胃癌生物學(xué)特性的關(guān)系[J].中華普通外科雜志,2000,15(4):4

[2]張成武,鄒壽椿,徐文娟,等.胃癌基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達(dá)的臨床意義[J].中國胃腸外科雜志,2000,3(1):25

[8]Littlepage LE,Sternlicht MD,Rougier N,et al.Matrix metalloproteinases contribute distinct roles in neuroendocrine prostate carcinogenesis, metastasis, and angiogenesis progression[J].Cancer Res,2010,70(6):2224

(2014-10-01 收稿 責(zé)任編輯李沛寰)

Expression of CD44v6 and MMP-9 proteins in gastric cancer tissue

WANGShuisheng,ZHAOChunlin,DINGChaohui,XUHuanan,YEYanwei

DepartmentofGastrointestinalSurgery，theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

gastric neoplasm;CD44v6;MMP-9;invasion and metastasis

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.031

R735.2