miRNA let-7b修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠脊髓損傷后脊髓NF-200、GFAP表達(dá)的影響

徐玉生，崔 浩，張 松，王培松，朱海洋，鐘 斌，苗金紅

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科 鄭州 450052 2)河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052

miRNA let-7b修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠脊髓損傷后脊髓NF-200、GFAP表達(dá)的影響

徐玉生1)△，崔 浩1)，張 松1)，王培松1)，朱海洋1)，鐘 斌1)，苗金紅2)

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科 鄭州 450052 2)河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052

△男，1969年3月生，博士，副主任醫(yī)師，副教授，研究方向：骨科疾病的基礎(chǔ)與臨床，E-mail：ysxu@zzu.edn.cn

miRNA let-7b；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；脊髓損傷；細(xì)胞移植；大鼠

目的：通過觀察miRNA let-7b修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)移植對(duì)脊髓損傷大鼠的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的作用，探討miRNA let-7b在損傷脊髓修復(fù)中的作用和機(jī)制。方法：60只成年SD大鼠分為對(duì)照組、BMSCs組、miRNA組，每組20只。采用改良Allen′s法制備脊髓損傷模型。造模后1周， BMSCs組行BMSCs移植，miRNA組移植miRNA let-7b慢病毒載體感染的BMSCs，對(duì)照組注射生理鹽水。移植后第3天至8周，按BBB標(biāo)準(zhǔn)量表對(duì)大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)分，用免疫組化方法檢測(cè)脊髓中神經(jīng)絲蛋白-200(NF-200)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，各組大鼠BBB評(píng)分和脊髓NF-200表達(dá)持續(xù)升高；不同時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分和脊髓NF-200表達(dá)以miRNA組最高，BMSCs組次之，對(duì)照組最低(P<0.05)。移植后各組脊髓GFAP表達(dá)均呈持續(xù)性增高，各時(shí)間點(diǎn)GFAP陽性表達(dá)面積以對(duì)照組最大，BMSCs次之，miRNA組最小(P<0.05)。結(jié)論：miRNA let-7b可能通過促進(jìn)BMSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞、抑制脊髓損傷后反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞的增生及膠質(zhì)瘢痕形成等機(jī)制促進(jìn)損傷后的神經(jīng)功能恢復(fù)。

脊髓損傷是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,常引起損傷節(jié)段以下肢體嚴(yán)重的功能障礙。隨著細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，外源性干細(xì)胞移植為脊髓損傷的治療提供了一種可能的方法。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)有較強(qiáng)的自我更新和增殖能力，有望成為治療脊髓損傷的“種子細(xì)胞”[1]。但由于移植后的BMSCs在宿主體內(nèi)成活率及轉(zhuǎn)化率較低，其應(yīng)用受到很大的限制。 miRNA是一類高度保守的非編碼小RNA分子，在生物體內(nèi)廣泛存在，對(duì)真核生物的基因表達(dá)、細(xì)胞周期調(diào)控和個(gè)體發(fā)育等均有影響[2-6]。該實(shí)驗(yàn)初步探討了miRNA let-7b修飾的BMSCs移植修復(fù)脊髓損傷的效果和可能機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)成年雌性SD大鼠60只，體重(230±20) g，購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(豫)2010-0002。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由飲食。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、BMSCs組、miRNA組，每組20只。

1.2 主要試劑 miRNA let-7b慢病毒載體及陰性對(duì)照慢病毒載體由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科賈延劼教授惠贈(zèng)，神經(jīng)絲蛋白-200(NF-200)抗體、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)兔抗大鼠多克隆抗體、SABC試劑盒、DAB試劑盒均購自北京博奧森有限公司。

1.3 脊髓損傷模型的建立 100 g/L的水合氯醛腹腔注射(300 mg/kg)麻醉大鼠。麻醉成功后，大鼠取俯臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，術(shù)區(qū)備皮、消毒鋪巾后，取背部正中切口，以胸12為中心顯露硬膜，于其上放置一長方形塑料墊片(約4 mm×5 mm)，用改良Allen′s法[7-8]以5 g×10 cm的力度撞擊脊髓。造模后大鼠出現(xiàn)雙后肢回縮樣撲動(dòng)、尾巴痙攣性擺動(dòng)，局部脊髓充血水腫，BBB評(píng)分小于8分，即認(rèn)為造模成功。生理鹽水沖洗后，再次消毒縫皮。術(shù)后1周內(nèi)每天給予青霉素20萬U/kg腹腔注射，術(shù)后每天給予人工輔助排尿2次。

1.4 干預(yù)方法 取傳代5次以上的大鼠BMSCs，接種到24孔板上(細(xì)胞密度約2×106mL-1)培養(yǎng)48 h。將含miRNA let-7b的慢病毒載體上清加入培養(yǎng)基中，感染復(fù)數(shù)為20，置于培養(yǎng)箱中孵育。同法制備陰性對(duì)照慢病毒載體感染的BMSCs。造模成功后1周，BMSCs組在損傷部位注射10 μL陰性對(duì)照慢病毒載體感染的大鼠BMSCs(細(xì)胞懸液密度為107mL-1)，注射時(shí)進(jìn)針方向與脊髓呈45°角，針頭指向損傷部位中央，進(jìn)針深度約為2 mm。同法miRNA組在損傷部位注射10 μL miRNA let-7b慢病毒載體感染的大鼠BMSCs(細(xì)胞懸液密度為107mL-1)。對(duì)照組僅在損傷部位注射10 μL生理鹽水。

1.5 BBB法評(píng)估大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)情況 各組分別于細(xì)胞移植后第3天、1周、2周、4周、8周取4只大鼠，由兩人按照BBB評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)量表進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分采用雙盲法，主要觀察大鼠的運(yùn)動(dòng)能力、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性和軀體穩(wěn)定性。后肢無運(yùn)動(dòng)功能為0分，運(yùn)動(dòng)功能完全正常為21分。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，3組間BBB評(píng)分、NF-200陽性細(xì)胞數(shù)及GFAP陽性表達(dá)面積的比較均采用析因設(shè)計(jì)的方差分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后一般情況觀察 實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)照組、BMSCs組各有1只大鼠因麻醉過深死亡被剔除，對(duì)照組1只、miRNA組2只因造模失敗被剔除，隨后在同一時(shí)間點(diǎn)通過隨機(jī)抽樣原則補(bǔ)齊動(dòng)物并重新造模。

造模成功后，3組大鼠均出現(xiàn)嚴(yán)重的雙后肢癱瘓及尿潴留，進(jìn)食及活動(dòng)情況均較術(shù)前減少。隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)展，3組大鼠活動(dòng)及進(jìn)食情況均逐漸好轉(zhuǎn)。細(xì)胞移植后3組大鼠BBB評(píng)分見表1。

表1 3組大鼠細(xì)胞移植后BBB評(píng)分比較(n=4)

F組間=28.717，F(xiàn)時(shí)間=54.586，F(xiàn)交互=24.865，P均<0.001；*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與BMSCs組比較，P<0.05。

2.2 3組大鼠脊髓組織NF-200的表達(dá) 移植后第3天，3組均能觀察到少量NF-200表達(dá)，以損傷區(qū)周圍最多。隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間進(jìn)展，3組NF-200陽性細(xì)胞均逐漸增多；4周時(shí)， miRNA組細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變，且可見具有典型神經(jīng)元形態(tài)的細(xì)胞。見圖1、表2。

2.3 3組大鼠脊髓組織GFAP的表達(dá) 移植后各時(shí)間點(diǎn)，3組均能觀察到GFAP表達(dá)，且隨時(shí)間變化其陽性表達(dá)面積呈持續(xù)性增高。見圖2、表3。

圖1 細(xì)胞移植4周后各組大鼠脊髓NF-200的表達(dá)(SABC，×400)

組別移植后第3天移植后1周移植后2周移植后4周移植后8周對(duì)照組8.78±0.9112.52±0.8717.26±1.0921.08±1.9629.78±1.04BMSCs組9.78±1.0429.92±2.70*36.03±3.39*44.25±2.98*47.54±1.35*miRNA組9.57±0.8642.69±2.47*#49.22±1.08*#57.47±1.09*#66.00±1.97*#

F組間=1 064.605，F(xiàn)時(shí)間=749.806，F(xiàn)交互=66.560，P均<0.001；*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與BMSCs組比較，P<0.05。

圖2 細(xì)胞移植4周后各組大鼠脊髓GFAP的表達(dá)(SABC，×400)

組別移植后第3天移植后1周移植后2周移植后4周移植后8周對(duì)照組2496.62±367.134107.93±351.945658.65±550.765818.14±325.795978.39±207.62BMSCs組2237.95±389.143515.56±542.14*4067.34±295.63*4027.93±112.77*3986.96±242.02*miRNA組2047.11±260.732306.41±426.87*#2985.25±274.80*#3145.20±171.90*#3015.83±367.66*#

F組間=187.241，F(xiàn)時(shí)間=82.313，F(xiàn)交互=9.994，P均<0.001；*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與BMSCs組比較，P<0.05。

3 討論

脊髓損傷的治療主要圍繞兩個(gè)方面：神經(jīng)細(xì)胞的再生和炎癥反應(yīng)的抑制。干細(xì)胞移植技術(shù)是將具有向成體細(xì)胞分化潛能的干細(xì)胞(如神經(jīng)干細(xì)胞、BMSCs等)移植到體內(nèi)，以達(dá)到修復(fù)或替換受損細(xì)胞或組織的目的。BMSCs在特定的微環(huán)境下可分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞[9-11]。另外發(fā)現(xiàn)BMSCs不僅能為損傷神經(jīng)的軸突再生提供基本骨架，而且其分泌的多種神經(jīng)營養(yǎng)因子參與損傷神經(jīng)的修復(fù)[12-14]。

miRNA作為一種廣泛存在的生物體調(diào)控物質(zhì)，在細(xì)胞的增殖、分化和凋亡中起重要作用。Simmons等[15]發(fā)現(xiàn)miRNA let-7b以T淋巴細(xì)胞白血病同源蛋白和細(xì)胞周期蛋白D1為靶點(diǎn)促進(jìn)BMSCs分化為神經(jīng)元，通過激活Wnt信號(hào)來調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的自我修復(fù)和更新。NF是構(gòu)成神經(jīng)元胞體和神經(jīng)軸突細(xì)胞骨架的主要成分，其在維持神經(jīng)元的功能中起重要作用，且脊髓損傷后NF-200陽性神經(jīng)元數(shù)量及胞體著色程度與后肢功能恢復(fù)密切相關(guān)[16]。GFAP是構(gòu)成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的骨架蛋白，脊髓損傷后期其合成和分泌均大量增加，GFAP的表達(dá)水平可以反映星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能狀態(tài)，其大量增生形成的膠質(zhì)瘢痕可能阻礙神經(jīng)軸突的生長，抑制損傷神經(jīng)的修復(fù)[17-18]。

該研究中發(fā)現(xiàn)3組大鼠NF-200的表達(dá)均隨實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展逐漸增加，且miRNA組在相同時(shí)間點(diǎn)均高于BMSCs組和對(duì)照組，而GFAP陽性表達(dá)面積降低。以上提示miRNA let-7b可能促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)元分化，分化的神經(jīng)元大量表達(dá)NF-200并減少膠質(zhì)瘢痕形成，以促進(jìn)神經(jīng)恢復(fù)。

綜上所述，該研究結(jié)果表明，miRNA let-7b在BMSCs向神經(jīng)元細(xì)胞的分化過程中起重要調(diào)控作用，并通過促進(jìn)軸突再生抑制膠質(zhì)瘢痕形成，為損傷神經(jīng)的恢復(fù)提供有利的外環(huán)境。但該實(shí)驗(yàn)是以動(dòng)物模型為研究對(duì)象，其安全性仍需進(jìn)一步研究。

[1]Colter DC,Class R,Digirolamo CM,et al.Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(7):3213

[2]徐玉生,張松,金偉林,等.褪黑素對(duì)大鼠脊髓損傷后腫瘤壞死因子-α表達(dá)的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2014,49(1):41

[3]Ji F,Lv X,Jiao J.The role of microRNAs in neural stem cells and neurogenesis[J].J Genet Genomics,2013,40(2):61

[4]Melton C,Judson RL,Blelloch R.Opposing microRNA families regulate self-renewal in mouse embryonic stem cells[J].Nature,2010,463(7281):621

[5]Bar M,Wyman SK,Fritz BR,et al.MicroRNA discovery and profiling in human embryonic stem cells by deep sequencing of small RNA libraries[J].Stem Cells,2008,26(10):2496

[6]Bilen J,Liu N,Burnett BG,et al.MicroRNA pathways modulate polyglutamine-induced neurodegeneration[J].Mol Cell,2006,24(1):157

[7]Hofstetter CP,Schwarz EJ,Hess D,et al.Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(4):2199

[8]胡愛民,張治國,侯志貞,等.褪黑素對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性脊髓損傷的神經(jīng)保護(hù)作用[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2011,36(2):164

[9]Ankeny DP,Mctigue DM,Jakeman LB.Bone marrow transplants provide tissue protection and directional guidance for axons after contusive spinal cord injury in rats[J].Exp Neurol,2004,190(1):17

[10]Chopp M,Zhang XH,Li Y,et al.Spinal cord injury in rat: treatment with bone marrow stromal cell transplantation[J].Neuroreport,2000,11(13):3001

[11]Chen J,Deng SW,Zhang S,et al.The role of miRNAs in the differentiation of adipose-derived stem cells[J].Curr Stem Cell Res Ther,2014,9(3):268

[12]Satake K,Lou J,Lenke LG.Migration of mesenchymal stem cells through cerebrospinal fluid into injured spinal cord tissue[J].Spine (Phila Pa 1976),2004,29(18):1971

[13]Zhao LX,Zhang J,Cao F,et al.Modification of the brain-derived neurotrophic factor gene: a portal to transform mesenchymal stem cells into advantageous engineering cells for neuroregeneration and neuroprotection[J].Exp Neurol,2004,190(2):396

[14]Zhao CN,Sun GQ,Li SX,et al.MicroRNA let-7b regulates neural stem cell proliferation and differentiation by targeting nuclear receptor TLX signaling[J].Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(5):1876

[15]Simmons A,Whitehead RP,Kolokoltsov AA.Use of recombinant lentivirus pseudotyped with vesicular stomatitis virus glycoprotein G for efficient generation of human anti-cancer chimeric T cells by transduction of human peripheral blood lymphocytes in vitro[J].Virol J,2006,3(3):8

[16]李一帆,陳東,薛輝,等.甲強(qiáng)龍、電針聯(lián)合羊膜上皮細(xì)胞移植對(duì)脊髓損傷大鼠軸漿運(yùn)輸功能及GFAP表達(dá)的影響[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2010,36(4):620

[17]Miller RH.Building bridges with astrocytes for spinal cord repair[J].J Biol,2006,5(3):6

[18]杜恒,戴星,馬巍,等.大鼠急性脊髓損傷中caspase-1的表達(dá)及意義[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2011,32(1):62

(2014-08-09 收稿 責(zé)任編輯姜春霞)

Effects of miRNA let-7b-modified bone mesenchymal stem cells transplantation on expressions of NF-200 and GFAP in rats with spinal cord injury

XUYusheng1),CUIHao1),ZHANGSong1),WANGPeisong1),ZHUHaiyang1),ZHONGBin1),MIAOJinhong2)

1)DepartmentofOrthopedics,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)Key-DisciplinesLaboratoryforClinicalMedicineofHenanProvince,Zhengzhou450052

miRNA let-7b;BMSC;spinal cord injury;cell transplantation;rat

Aim: To explore the effects of miRNA let-7b-modified BMSCs transplantation on the repair of nerve in rats with spinal cord injury.Methods: A total of 60 SD rats were randomly divided into 3 groups：control group,BMSCs group, and miRNA group, each group including 20 rats. At 1 week after the spinal cord injury model being established, the control group received physical saline, the BMSCs group was injected with BMSCs,and the miRNA group was treated with BMSCs transfected with miRNA let-7b. The neurological functions were evaluated using the BBB scale after operation.NF-200 and GFAP were detected.Results: After cell transplantation, the BBB scores were the lowest in control group and lower in BMSCs group(P<0.05). After implantation，NF-200-positive cells of miRNA group was much more than the other two groups, while the GFAP positive area was the lowest in miRNA group and lower in BMSCs group(P<0.05).Conclusion: miRNA let-7b may play an important role in the differentiation of BMSCs into neurons, and promote recovery of injured spinal cord through decreasing the formation of glial scar.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.024

R651.2