轉染TDP-25對SH-SY5Y細胞自噬蛋白表達及細胞活力、凋亡的影響*

周玉帥，殷競爭，張瑞鋒，滕軍放#

1)鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052 2)河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室 鄭州 450052

轉染TDP-25對SH-SY5Y細胞自噬蛋白表達及細胞活力、凋亡的影響*

周玉帥1,2)，殷競爭1,2)，張瑞鋒1,2)，滕軍放1,2)#

1)鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052 2)河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室 鄭州 450052

#通信作者，男，1960年11月生，博士，教授，主任醫師，研究方向：神經系統退行性疾病，E-mail:13838210077@163.com

TDP-25；自噬；細胞活力；細胞凋亡

目的：探討TDP-25對SH-SY5Y細胞自噬蛋白表達及細胞活力、凋亡的影響。方法：將神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y分為3組，分別轉染質粒GFP-N1、GFP-TDP-43和GFP-TDP-25，24 h后應用免疫熒光法檢測包涵體，Western blot法檢測LC3、 Beclin-1蛋白的表達情況。將SH-SY5Y細胞轉染質粒GFP-TDP-25后分為2組，一組加自噬抑制劑3-MA,一組不加3-MA,MTT比色法檢測細胞活力，Annexin-V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡情況。結果：GFP-N1組細胞胞質、胞核均見較強綠色熒光信號；GFP-TDP-43組較強的綠色熒光信號分布于胞核中，未見明顯的包涵體形成；GFP-TDP-25組可見較強的綠色熒光信號顆粒狀分布于胞質中，形成包涵體；3組Beclin-1表達水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ差異有統計學意義(F=192.700、247.420，P<0.05)，GFP-TDP-25組Beclin-1表達水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ大于GFP-TDP-43組(P<0.05)，后者大于GFP-N1組(P<0.05)。加入3-MA后，轉染GFP-TDP-25的細胞細胞活力降低，細胞凋亡率增高(t=38.595、5.920，P<0.001)。結論：TDP-25可能通過上調細胞巨自噬水平減弱其對細胞的損害。調控巨自噬水平對肌萎縮性側索硬化癥和額顳葉變性患者的病情進展可能起到一定的延緩作用。

TDP-43(transactive response DNA-binding protein of 43 000)是一種DNA和RNA結合蛋白，在心臟、腎臟、肌肉和中樞神經系統中廣泛表達[1]，結構上含有兩個RNA識別基序，N端區域具有核定位信號(NLS)和核輸出信號(NES)，同時N端區域還具有3個Caspase-3水解位點(TDP-43可被水解形成截短型片段)，C末端區域富含甘氨酸序列，介導蛋白間的相互作用[2]。生理狀態下TDP-43主要定位于胞核，通過與DNA和RNA結合，參與轉錄、剪切等過程，也參與細胞凋亡、細胞分裂和神經可塑性的調節等過程[3]。病理狀態下，移位至胞質的TDP-43被過磷酸化、泛素化和水解生成保留C末端的截短型片段(TDP-35和TDP-25)，可溶性降低并形成聚集物，喪失功能。Neumann等[4]研究發現肌萎縮性側索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)和額顳葉變性(frontotemporal lobar degeneration，FTLD)患者腦組織中存在TDP-43陽性包涵體，其主要成分為過磷酸化、泛素化TDP-43和TDP-35、TDP-25。自噬(autophagy)作為細胞降解受損細胞器和異常蛋白的途徑之一，是否參與TDP-43陽性包涵體的形成，TDP-25是否參與ALS和FTLD的致病過程至今仍不清楚。作者構建了過表達TDP-25的神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y模型，觀察模型細胞包涵體形成情況、細胞活力和凋亡的變化、自噬蛋白LC3和 Beclin-1的表達情況，探討TDP-25與自噬的關系，初步探討ALS和FTLD可能的發病機制。

1 材料與方法

1.1 材料 SH-SY5Y細胞由中南大學湘雅醫院唐北沙教授饋贈；質粒GFP-N1、GFP-TDP-43 和GFP-TDP-25由課題組構建；DMEM高糖培養基及胎牛血清均購自Gibco公司；Lipofectamine?2000轉染試劑購自Invitrogen公司；Beclin-1、LC3一抗均購自Abcam公司，GAPDH購自Santa Cruz公司；過氧化物酶標記山羊抗兔IgG購自Promega公司；自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)、噻唑藍(MTT)均購自Sigma公司。

1.2 細胞培養 將SH-SY5Y細胞培養于含體積分數10%胎牛血清的培養基中，于37 ℃、體積分數5%CO2培養箱中培養，根據細胞生長情況，2～3 d傳代1次。取對數生長期且狀態良好的細胞進行實驗。

1.3 細胞中包涵體的檢測 調整細胞密度為5×105mL-1，以1.5 mL/孔接種于12孔板，隨機分為3組，24 h后脂質體轉染法分別轉染GFP-N1、GFP-TDP-43 和GFP-TDP-25，轉染24 h后每孔用40 g/L多聚甲醛固定10 min，1×PBS漂洗3遍后，應用熒光顯微鏡(Olympus DP71)在320倍視野下觀察，分析熒光情況，抽取10個不相重復的視野拍照。實驗重復3次。

1.5 細胞活力的檢測 調整細胞密度為5×105mL-1，以0.1 mL/孔接種于96孔板，隨機分為2組，每組16個復孔，24 h后轉染GFP-TDP-25，轉染12 h后一組每孔給予10 mmol/L 3-MA處理(GFP-TDP-25+3-MA組)，另一組不予處理(GFP-TDP-25組)。轉染24 h后加入5 g/L MTT溶液20 μL，孵育4 h后棄培養基，加入100 μL二甲基亞砜，選擇570 nm波長測定吸光度值，表示細胞活力。實驗重復3次。

1.6 細胞凋亡的檢測 調整細胞密度為5×105mL-1，以2 mL/孔接種于6孔板，隨機分為2組，分組處理方法同1.5。轉染 24 h 后細胞均用0.14 g/L EDTA消化，調整每組細胞密度為5×105mL-1，各取100 μL細胞懸液加入5 μL Annexin-V-FITC和10 μL 20 g/L PI溶液，孵育15 min后上流式細胞儀檢測(Ex=488 nm，Em=530 nm)。

1.7 統計學處理 應用SPSS 19.0進行統計學處理，GFP-N1、GFP-TDP-43和GFP-TDP-25組細胞LC3、Beclin-1表達情況的比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗，GFP-TDP-25+3-MA和GFP-TDP-25組細胞活力、凋亡率的比較采用兩獨立樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 包涵體檢測結果 見圖 1。GFP-N1組細胞胞質、胞核均見較強綠色熒光信號；GFP-TDP-43組較強的綠色熒光信號分布于胞核中，未見明顯的包涵體形成；GFP-TDP-25組可見較強的綠色熒光信號顆粒狀分布于胞質中，形成包涵體。

2.2 GFP-N1、GFP-TDP-43 和GFP-TDP-25組細胞中LC3、 Beclin-1蛋白表達的比較 見圖2、表1。GFP-TDP-25組Beclin-1/GAPDH及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ大于GFP-TDP-43組，后者大于GFP-N1組。

組別nLC3-Ⅱ/LC3-ⅠBeclin-1/GAPDHGFP-N1組360.051±0.0090.010±0.005GFP-TDP-43組360.135±0.045*0.016±0.002*GFP-TDP-25組360.326±0.095*#0.040±0.009*#F192.700247.720P<0.001<0.001

*：與GFP-N1組比較，P<0.05；#：與GFP-TDP-43組比較，P<0.05。

2.3 GFP-TDP-25+3-MA和GFP-TDP-25組細胞活力、凋亡率的比較 見表2。

表2 GFP-TDP-25+3-MA和GFP-TDP-25組細胞活力、凋亡率的比較

與GFP-TDP-25組比較，GFP-TDP-25+3-MA組細胞活力降低，而細胞凋亡率增高。

3 討論

ALS是一種致命的運動神經元疾病，臨床表現為進行性肌無力、肌萎縮等，該病無法治愈，患者最終因呼吸衰竭而死亡，從發現臨床癥狀開始，平均生存期為2～4 a[5-6]。在65歲以下的人群中FTLD是第二大常見的癡呆性疾病[7]，其臨床表現為行為異常、言語障礙和運動障礙等[8]，絕大多數患者發病年齡在45～65歲，病程2～20 a，平均約8 a，目前無有效的治療方案[9]。其臨床癥狀和神經系統的病理特點與ALS有一定重疊性，說明ALS和FTLD可能是同一種神經退行性疾病，只是易感神經元不同[10]。Neumann等[4]研究發現，ALS和FTLD患者神經組織中存在TDP-43陽性包涵體，TDP-25為其主要成分，TDP-25的產生機制可能與Caspase-3有關。Zhang等[11]研究發現抑制顆粒蛋白前體基因(PGRN)表達后Caspase-3被激活，TDP-43被水解形成TDP-25。

該實驗結果顯示，外源性TDP-43并未在神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y中形成包涵體，TDP-43定位于胞核；而轉染TDP-25的細胞形成包涵體，TDP-25分布于胞質；說明TDP-25與包涵體的形成有關。Winton等[12]研究發現TDP-25缺乏NLS，因此無法進入細胞核而聚集于胞質內。有研究[2]發現TDP-25被磷酸化后水溶性降低且具有細胞毒性。Caccamo等[13]研究發現過表達TDP-25可誘導內源性TDP-43于胞質中聚集，隨之胞核中的TDP-43水平降低。因此推測包涵體的形成與TDP-25本身易聚集等特點和其對TDP-43的作用有關。

自噬是細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質的過程，根據底物進入溶酶體途徑的不同分為3類：巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侶介導的自噬(chaperone -mediated autophagy，CMA)。通常說的自噬是指巨自噬[14-15]。自噬是一種可誘導的過程，病理學損傷和蛋白異常聚集均可上調自噬水平，自噬通過降解異常聚集、錯誤折疊的蛋白和受損的細胞器等來減輕細胞損害，從而起到保護作用。然而過度的自噬可誘導細胞死亡，即自噬性細胞死亡[16]。LC3、Beclin-1作為巨自噬的分子標記物，已成為檢測巨自噬活性的重要方法。Beclin-1和LC3-Ⅱ表達水平高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增大，說明巨自噬水平上調，反之說明巨自噬水平下調[17-19]。

該實驗結果顯示，GFP-TDP-25組細胞Beclin-1蛋白表達水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值高于GFP-TDP-43組和GFP-N1組，說明過表達TDP-25誘導了細胞巨自噬水平。進一步研究發現，與GFP-TDP-25組比較，加入自噬抑制劑 3-MA的GFP-TDP-25+3-MA組細胞凋亡率較增加，細胞活力減弱,說明TDP-25可能通過上調細胞巨自噬水平減弱其對細胞的損害。有研究[13,20]發現自噬參與降解異常的TDP-43、TDP-25，抑制自噬后TDP-25的聚集增加，誘導自噬后可降低TDP-25的聚集和恢復TDP-43的核定位。因此推測，作為一種細胞保護機制，上調巨自噬可能加速清除TDP-43陽性包涵體，從而減輕TDP-25誘導的細胞損害，對ALS和FTLD患者病情進展可能起到一定的延緩作用。

[1]Buratti E,D?rk T,Zuccato E,et al.Nuclear factor TDP-43 and SR proteins promote in vitro and in vivo CFTR exon 9 skipping[J].EMBO J,2001,20(7):1774

[2]Zhang YJ,Xu YF,Cook C,et al.Aberrant cleavage of TDP-43 enhances aggregation and cellular toxicity[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2009,106(18):7607

[3]Mackenzie IR,Rademakers R.The role of transactive response DNA-binding protein-43 in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia[J].Curr Opin Neurol,2008,21(6):693

[4]Neumann M,Sampathu DM,Kwong LK,et al.Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis[J].Science,2006,314(5796):130

[5]Chiò A,Logroscino G,Traynor BJ,et al.Global epidemiology of amyotrophic lateral sclerosis: a systematic review of the published literature[J].Neuroepidemiology,2013,41(2):118

[6]Blokhuis AM,Groen EN,Koppers M,et al.Protein aggregation in amyotrophic lateral sclerosis[J].Acta Neuropathol,2013,125(6):777

[7]Harvey RJ,Skelton-Robinson M,Rossor MN.The prevalence and causes of dementia in People under the age of 65 years[J].J Neurol Neurosurg Psychiatry,2003,74(9):1206

[8]Rascovsky K,Grossman M.Clinical diagnostic criteria and classification controversies in frontotemporal lobar degeneration[J].Int Rev Psychiatry,2013,25(2):145

[9]Snowden JS.Frontotemporal dementia[J].Br J Psychiatry,2002,180(2):140

[10]Mackenzie IR,Feldman HH.Ubiquitin immunohistochemistry suggests classic motor neuron disease, motor neuron disease with dementia, and frontotemporal dementia of the motor neuron disease type represent a clinicopathologic spectrum[J].J Neuropathol Exp Neurol,2005,64(8):730

[11]Zhang YJ,Xu YF,Dickey CA,et al.Progranulin mediates caspase-dependent cleavage of TAR DNA binding protein-43[J].J Neurosci,2007,27(39):10530

[12]Winton MJ,Igaz LM,Wong MM,et al.Disturbance of nuclear and cytoplasmic TAR DNA-binding protein (TDP-43) induces disease-like redistribution, sequestration, and aggregate formation[J].J Biol Chem,2008,283(19):13302

[13]Caccamo A,Majumder S,Deng JJ,et al.Rapamycin rescues TDP-43 mislocalization and the associated low molecular mass neurofilament instability[J].J Biol Chem,2009,284(40):27416

[14]Levine B,Kroemer G.Autophagy in the pathogenesis of disease[J].Cell,2008,132(1):27

[15]楊璟輝，高曉剛，傅志仁，自噬在肝臟免疫耐受中的作用機制研究進展[J].解放軍醫學雜志，2014，39(6)：503

[16]Eskelinen EL,Saftig P.Autophagy: a lysosomal degradation pathway with a central role in health and disease[J].Biochim Biophys Acta,2009,1793(4):664

[17]Crotzer VL,Blum JS.Autophagy and intracellular surveillance: modulating MHC class Ⅱ antigen presentation with stress[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2005,102(22):7779

[18]方立,王雪晶,荊婧,等.rhG-CSF對大鼠缺血缺氧神經元巨自噬水平的影響[J].鄭州大學學報:醫學版,2013(6):753

[19]郭倩倩，劉志燕，姜麗麗，等.營養缺乏對人肺癌細胞自噬的誘導作用[J].南方醫科大學學報，2014,34(5)：627

[20]Wang X,Fan H,Ying Z,et al.Degradation of TDP-43 and its pathogenic form by autophagy and the ubiquitin-proteasome system[J].Neurosci Lett,2010,469(1):112

(2014-10-27 收稿 責任編輯王 曼)

Expression of autophagy proteins and cell vitality,apoptosis of SH-SY5Y cells transfected with TDP-25

ZHOUYushuai1,2)，YINJingzheng1,2)，ZHANGRuifeng1,2)，TENGJunfang1,2)

1)DepartmentofNeurology，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)Key-DisciplinesLaboratoryforClinicalMedicineofHenanProvince，Zhengzhou450052

TDP-25；autophagy；cell vitality;cell apoptosis

Aim: To investigate the effect of TDP-25 transfection on autophagy,vitality,and apoptosis of SH-SY5Y cells.Methods: The recombinated plasmids GFP-N1,GFP-TDP-43 and GFP-TDP-25 were transfected into SH-SY5Y cells through eukaryotic cell transfection technique for 24 h,then immunofluorescence assay was performed to observe the form of ubiquitinated inclusions(UBIs), and the expressions of LC3 and Beclin-1 were detected using Western blot assay. SH-SY5Y cells were transfected with GFP-TDP-25, and treated with 3-MA,then the cell vitality was measured using MTT, and apoptosis was assayed with flow cytometry. Results:UBIs were localized at the cytoplasm in the cells of GFP-TDP-25 group.There were significant differences in the expression levels of Beclin-1 and the ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰamong GFP-N1,GFP-TDP-43 and GFP-TDP-25 groups(F=192.700,247.420，P<0.05), and the expression level of Beclin-1 and the ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ in GFP-TDP-25 group was the highest(P<0.05). Cell vitality of the cells transfected with GFP-TDP-25 and treated with 3-MA was lower and apoptosis rate were higher than cells only transfected with GFP-TDP-25(t=38.595,5.920，P<0.001).Conclusion: TDP-25 might weaken the cell damage through upregulating the level of macroautophagy.It maybe helps to inhibit the progress of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration through a proper regulation of macroautophagy.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.022

*鄭州市科技攻關項目 131PLJRC675

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