脊髓缺血再灌注損傷對兔脊髓微循環的影響*

方 華，章建平#，章放香，張競超，王泉云，王儒蓉,劉 進

1)貴陽醫學院附屬人民醫院麻醉科 貴陽 550002 2)四川大學華西醫院麻醉科 成都 610041

脊髓缺血再灌注損傷對兔脊髓微循環的影響*

方 華1)，章建平1)#，章放香1)，張競超1)，王泉云2)，王儒蓉2),劉 進2)

1)貴陽醫學院附屬人民醫院麻醉科 貴陽 550002 2)四川大學華西醫院麻醉科 成都 610041

#通信作者，女，1979年6月生，碩士研究生，主治醫師，研究方向：臨床麻醉學，E-mail:zhangjianping666@126.com

脊髓；缺血再灌注；微循環；核轉錄因子-κB；兔

目的：探討脊髓缺血再灌注損傷(SCIRI)對脊髓微循環的影響。方法：采用腎下腹主動脈阻斷模型,分別阻斷兔腹主動脈30(C30組)、45(C45組)和60 min(C60組)后再灌注, 假手術組(C0組)不阻斷血流。于缺血前、缺血期間、再灌注期間監測脊髓微循環血流速度和微循環血流量(SCMBF)，再灌注120 min后觀察脊髓組織中丙二醛(MDA)含量，誘生型一氧化氮合酶(iNOS)、髓過氧化物酶(MPO)、活性氧(ROS)活力，核轉錄因子-κBp65 (NF-κBp65)、抑制蛋白-κBα(I-κBα)和細胞間黏附分子-1(ICAM-1)蛋白的表達及脊髓病理學變化。結果：C30、C45、C60組脊髓組織分別表現為輕、中、重度SCIRI病理學改變。缺血再灌注期間，4組脊髓微循環血流速度和SCMBF的變化差異有統計學意義(F組間=12.051和54.514，F時間=66.084和171.028，F交互=12.032和35.752，P均<0.05)；C45、C60組再灌注120 min時SCMBF仍未恢復至術前水平(P<0.05)。再灌注120 min 時，C0、C30、C45、C60組脊髓組織中MDA含量和iNOS、MPO、ROS活力依次增高(P<0.05)，NF-κBp65和ICAM-1蛋白表達依次增強(P<0.05)，I-κBα表達依次降低(P<0.05)。結論：脊髓微循環狀態能夠敏感而準確地反映SCIRI程度, ICAM-1和NF-κBp65表達上調加重脊髓微循環障礙。

微循環障礙是脊髓缺血再灌注損傷(spinal cord ischemia-reperfusion injury, SCIRI)中重要的病理生理學特征[1-2]。脊髓神經功能的維持依賴于微循環結構的完整，脊髓微循環障礙將嚴重影響SCIRI術后神經功能的恢復[3-6]。微循環障礙的發生發展與細胞間黏附分子(intercellular adhesion molecule，ICAM-1)等炎癥信號轉導啟動的炎癥反應有關，而核轉錄因子-κBp65(nuclear factor-kappa Bp65，NF-κBp65)和抑制蛋白-κBα(inhibitor-kappa Bα，I-κBα)的相互作用在調控炎癥反應信號轉導方面起重要作用[3-6]。作者比較了不同程度SCIRI模型兔脊髓微循環血流量(spinal cord microcirculatory blood flow，SCMBF)和血流速度的變化規律，同時觀察了脊髓組織中ICAM-1、NF-κBp65和 I-κBα表達的變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 鼠抗兔ICAM-1、I-κBα及 NF-κBp65 多克隆抗體均為Sigma公司產品；SABC檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒、活性氧(reactive oxygen species，ROS)活力檢測試劑盒、誘生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)活力檢測試劑盒及髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活力檢測試劑盒均為中國上海研吉生物科技有限公司產品。

1.2 動物模型的建立及實驗分組 4～6月齡健康純種新西蘭大耳白兔40只，由四川大學實驗動物中心提供，體重2.0～2.5 kg，雌雄不拘，按照隨機數字表法分為假手術組(C0組)、C30、C45和C60組，每組10只。采用左腎動脈下方腹主動脈阻斷法建立SCIRI動物模型[7]：耳緣靜脈注射30 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉兔后，無菌條件下取腹正中切口,仔細分離并顯露左腎動脈及腹主動脈,于左腎動脈起始點下方約0.5 cm處，用中號動脈夾暫時夾閉腹主動脈，夾閉前經耳緣靜脈注射肝素1 mg/kg。證實鉗夾點以下腹主動脈搏動完全消失后,C30、C45、C60組分別在阻斷30、45和60 min后取消夾閉，開放腹主動脈行再灌注，時間均為120 min。C0組不阻斷腹主動脈，其他操作同上。左腹股溝區備皮，消毒鋪巾后股動脈插管監測血壓并抽取血氣。術中以生理鹽水浸潤的溫紗墊覆蓋腹腔臟器，肛門溫度維持在36～37 ℃。術中監測心電圖(ECG)、動脈血氣、經皮脈搏氧飽和度、平均動脈壓及肛門溫度。

1.3 觀測指標

1.3.1 脊髓微循環血流速度和SCMBF的測量 選用Peri Flux System 5001型多通道系統激光多普勒血流儀(瑞典PERIMED公司)測定缺血前、缺血1 min、缺血5 min、再灌注15 min、再灌注30 min、再灌注60 min和再灌注120 min時L3/4段的SCMBF：無菌條件下取背部正中切口，逐層切開背部皮膚、皮下及肌肉組織，充分暴露L3/4段腰椎間隙，用細嘴咬骨鉗咬去雙側椎板，顯露L3/4段脊髓。將無菌激光掃描探頭與暴露的脊髓面成90°角貼于L3/4硬脊膜上，以獲取脊髓微循環血流信號[8]；將標準光纖探頭置于腰椎旁肌表面作為對照。血流速度單位為VU(velocity unit)，SCMBF的單位為PU(perfusion unit)。C0組在對應時間點測定血流速度和SCMBF。

1.3.2 脊髓組織病理學觀察及ICAM-1、I-κBα和NF-κBp65蛋白的檢測 各組分別于再灌注120 min后取L3/4節段脊髓組織,于福爾馬林中固定。取一部分脊髓組織常規HE染色后，采用OlympusBX51圖像采集分析系統等距隨機抽樣法觀察脊髓組織病理學表現。另取一部分脊髓組織，采用免疫組化SABC法測定脊髓組織中ICAM-1、I-κBα和NF-κBp65的表達。參照文獻[9]，使用OlympusBX51圖像采集分析系統等距隨機抽樣攝片并定量分析各時間點ICAM-1、I-κBα和NF-κBp65細胞核陽性細胞百分數和胞核平均灰度值。

1.3.3 脊髓組織中MDA含量和iNOS、MPO及ROS活力檢測 各組分別于再灌注120 min后取L3/4節段脊髓組織,加入4 ℃生理鹽水超聲勻漿，3 500 r/min離心5 min后取上清液置于-80 ℃冰箱凍存，采用硫代巴比妥酸法測定脊髓組織中MDA含量，采用Fenton自由基反應法測定iNOS活力，采用過氧化氫還原法測定MPO活力，采用催化L-Arg氧反應法測定ROS活力，均按照試劑盒說明書操作。

1.4 統計學處理 采用SPSS 16.0進行統計分析，組間血流速度和SCMBF的比較采用重復測量數據的方差分析，組間MDA含量，iNOS、MPO、ROS活力和目的蛋白表達水平的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 動物一般情況 手術結束2 h內實驗動物均完全清醒。實驗過程中，動物均無意外死亡。

2.2 4組血流速度和SCMBF的比較 見表1、2。C0組血流速度和SCMBF均無明顯變化。缺血后各損傷組血流速度和SCMBF均較缺血前迅速下降，缺血5 min時血流波形消失。C30組再灌注15和30 min時血流速度和SCMBF均高于缺血前，再灌注60和120 min時則明顯下降至缺血前水平。C45、C60組再灌注15和30 min時血流速度和SCMBF均高于缺血前和同期C30組水平，再灌注60和120 min時血流速度和SCMBF均明顯低于缺血前和同期C30組水平，C60組變化較C45組更顯著。

表1 4組脊髓血流速度的比較 VU

F組間=12.051，F時間=66.084，F交互=12.032，P均<0.001；*:與缺血前比較，P<0.01;#:與C30組比較，P<0.01;▲:與C45組比較,P<0.01。

表2 4組脊髓SCMBF的比較 PU

F組間=54.514，F時間=171.028，F交互=35.752，P均<0.001；*:與缺血前比較，P<0.01;#:與C30組比較，P<0.01;▲:與C45組比較,P<0.01。

2.3 4組脊髓組織病理學表現 C0組脊髓組織結構完整，無出血、水腫等病理學表現，運動神經元輪廓清晰(圖1A)。C30組脊髓組織中可見出血灶，運動神經元輕度腫脹，周圍間隙增加，部分核仁不清(圖1B)。C45組脊髓組織內出血灶明顯，運動神經元顯著腫脹，周圍間隙明顯增加，核仁不清，少量運動神經元空泡形成或變性壞死(圖1C)。C60組脊髓組織內可見大片狀出血灶，大量運動神經元變性壞死及廣泛空泡形成(圖1D)。

圖1 脊髓病理學表現(HE， ×400)

2.4 4組脊髓組織中NF-κBp65、I-κBα和ICAM-1表達水平的比較 見表3。C0、C30、C45、C60組脊髓組織中NF-κBp65和ICAM-1蛋白表達依次增強，I-κBα表達則依次減弱。

2.5 4組脊髓組織中MDA含量及iNOS、MPO、ROS活力的比較 見表4。再灌注120 min時,C0、C30、C45、C60組MDA含量和iNOS、MPO、ROS活力依次增高。

表3 4組脊髓組織中NF-κBp65、I-κBα和ICAM-1表達的比較

*:與C0組比較,P<0.01;#：與C30組比較,P<0.01;▲：與C45組比較,P<0.01。

表4 4組脊髓組織中iNOS、ROS、MPO活力及MDA含量的比較

*:與C0組比較,P<0.01;#：與C30組比較，P<0.01;▲：與C45組比較,P<0.01。

3 討論

脊髓神經功能的維持依賴于微循環結構的完整，SCIRI期間脊髓微循環障礙將嚴重影響術后神經功能的恢復[3-6]。該實驗中，麻醉藥物戊巴比妥鈉對SCMBF無明顯影響[9]，而阻斷腹主動脈血流1 min后脊髓微循環血流速度和SCMBF較缺血前明顯降低，阻斷腹主動脈5min時微循環灌注波形完全消失，提示阻斷水平以下脊髓血液循環完全被阻斷，說明血流速度和SCMBF可靈敏反映脊髓微循環狀態。為不影響術中完整的脊髓微循環監測，監測過程中未采集脊髓組織進行病理學觀察及生化指標檢測。

該研究中在灌注120 min后，C30組表現為運動神經元輕度腫脹及周圍間隙增加等輕度SCIRI病理學改變，C45組表現為運動神經元明顯腫脹及核固縮等中度SCIRI病理學改變，C60組表現為運動神經元廣泛性溶解及壞死等重度SCIRI病理學改變，說明腹主動脈血流阻斷30、45及60 min后再灌注可分別引起輕、中和重度SCIRI。輕度SCIRI(C30組)再灌注60 min后脊髓微循環能夠恢復至缺血前水平，提示輕度SCIRI中微循環障礙具有可逆性，微循環功能可以自行恢復，術后脊髓神經功能可能恢復較好；中、重度SCIRI(C45和C60組)再灌注15和30 min后脊髓微循環表現為病理性高灌流狀態，再灌注60 min后脊髓微循環表現為延遲性低灌流狀態，且中、重度SCIRI中脊髓微循環功能變化存在明顯差異，中度SCIRI(C45組)再灌注60 min后血流速度和SCMBF均顯著高于重度SCIRI(C60組)，提示中度SCIRI中微循環功能僅僅部分恢復，而重度SCIRI中微循環功能與結構的完整性受到不可逆破壞。

中樞神經系統中普遍存在著NF-κBp65/I-κBα炎癥信號轉導系統，靜息狀態下NF-κBp65與I-κBα以同源或異源二聚體非活性形式錨定于細胞質內，只有I-κBα磷酸化后NF-κBp65/I-κBα二聚體解離，NF-κBp65才具備活性[10-11]。該研究發現，輕、中和重度SCIRI再灌注120 min后脊髓組織中I-κBα蛋白表達逐漸降低，而NF-κBp65和ICAM-1蛋白表達逐漸升高，提示SCIRI時脊髓組織中NF-κBp65/I-κBα炎癥信號轉導系統啟動，調控ICAM-1表達上調，引發炎癥反應。ROS和iNOS可通過直接誘導I-κBα蛋白水解磷酸化啟動NF-κBp65/I-κBα炎癥信號轉導系統[12-13]。MDA、ROS及MPO是中性粒細胞活化過程中脂質過氧化反應中的炎癥因子[14-16]。iNOS可通過NO自由基與超氧自由基反應生成超氧亞硝基陰離子ONOO-而損傷細胞[17-18]。該研究結果表明，中、重度SCIRI脊髓微循環障礙時脊髓組織中NF-κBp65及ICAM-1蛋白表達升高的同時，MDA含量和MPO、iNOS、ROS活力也顯著增強，提示在脊髓微循環障礙狀態下MDA、iNOS、MPO及ROS等炎癥介質可能通過NF-κBp65/I-κBα途徑引發炎癥反應，加重SCIRI。

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(2014-11-25 收稿 責任編輯王 曼)

Effects of spinal cord ischemia-reperfusion injury on rabbit spinal cord microcirculatory

FANGHua1),ZHANGJianping1),ZHANGFangxiang1),ZHANGJingchao1),WANGQuanyun2),WANGRurong2),LIUJin2)

1)DepartmentofAnesthesiology,theAffiliatedPeople’sHospital,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550002 2)DepartmentofAnesthesiology,WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041

spinal cord；ischemia-reperfusion；microcirculatory；NF-κB;rabbit

Aim: To investigate the effects of spinal cord ischemia-reperfusion injury(SCIRI) on spinal cord microcirculatory.Methods: The kidney ventral aorta block model was established and the rabbit abdominal aorta were blocked for 0(C0 group), 30(C30 group), 45(C45 group) and 60(C60 group) min, respectively.During ischemia and reperfusion, velocity and microcirculation blood flow(SCMBF) were monitored. After 120 min reperfusion, the pathological observation of spinal cord tissue was performed, and malondialdehyde(MDA) content, the activity of inducible nitric oxide synthase(iNOS), myeloperoxidase(MPO), reactive oxygen species(ROS), nuclear factors-kappa Bp65 (NF-κBp65), inhibitor-kappa Bα(I-κBα) and intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) protein expression were detected. Results: The C30, C45, C60 group performanced mild, medium and heavy SCIRI pathological manifestations. During the period of ischemia and reperfusion, the differences in changes of the velocity and SCMBF among the four groups were statistically significant (Fgroup=12.051 and 54.514,Ftime=66.084 and 171.028,Finteraction=12.032 and 35.752,P<0.05); SCMBF of C45, C60 groups still had not returned to preoperative levels after 120 min reperfusion(P<0.05). After 120 min reperfusion, MDA content and the activity of iNOS, MPO and ROS in C0, C30, C45, and C60 groups increased in turn(P<0.05), the NF-κBp65 and ICAM-1 expression increased in turn(P<0.05), and I-κBα expression reduced(P<0.05). Conclusion: Spinal cord microcirculation monitoring can sensitively and accurately reflect the degree of SCIRI. The upregulation of the expressions of ICAM-1 and NF-κBp65 might aggravate the spinal cord SCIRI during microcirculatory dysfunction.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.007

*貴州省衛生廳基金項目 gzwkj2010-1-006，gzwkj2012-1-015；貴州省科技廳基金項目 黔科合SY字[2011]008號，黔科SY字[2012]3090號

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