不同時期鉛暴露對小鼠學習記憶能力及海馬組織中β淀粉樣蛋白表達的影響*

李 靜，劉芳麗，安偉鋒，薛振菲，李文杰#

1)鄭州大學公共衛生學院營養與食品衛生學教研室 鄭州 450001 2)河南大學護理學院 開封 475004 3)河南省疾病預防控制中心健康教育與慢病防治研究所 鄭州 450001 4)北京西城區陶然亭社區衛生服務中心 北京 100052

不同時期鉛暴露對小鼠學習記憶能力及海馬組織中β淀粉樣蛋白表達的影響*

李 靜1)，劉芳麗2)，安偉鋒3)，薛振菲4)，李文杰1)#

1)鄭州大學公共衛生學院營養與食品衛生學教研室 鄭州 450001 2)河南大學護理學院 開封 475004 3)河南省疾病預防控制中心健康教育與慢病防治研究所 鄭州 450001 4)北京西城區陶然亭社區衛生服務中心 北京 100052

#通信作者,男，1958年11月生，教授，研究方向：營養及相關疾病，E-mail：lwj@zzu.edu.com

鉛；小鼠；學習記憶能力；β淀粉樣蛋白

目的：探討不同時期鉛暴露對小鼠學習記憶能力以及海馬組織中β淀粉樣蛋白(Aβ)表達的影響。方法：將40只健康雄性仔鼠隨機分為生長期暴露組[母鼠飲2 g/L的醋酸鉛水溶液經母乳給仔鼠染毒，直至斷乳(21 d)]、成年期暴露組(出生后第180～240天給予2 g/L的醋酸鉛水溶液)、共同暴露組(按照上述方式在生長期及成年期均染鉛)以及對照組(飲用去離子水)4組，每組10只。1 a后，分別用Morris水迷宮及ELISA測定各組小鼠的學習記憶能力以及海馬組織中Aβ含量。結果：各組小鼠平均逃避潛伏期差異有統計學意義(F時間=396.688，F組間=177.902，P均<0.001)；各暴露組小鼠穿越平臺次數少于對照組(F=30.394,P<0.001)，生長期暴露組和共同暴露組小鼠穿越平臺的次數少于成年期暴露組(P均<0.05)；各暴露組小鼠海馬組織中Aβ含量高于對照組(F=346.032和53.796,P均<0.001)，且生長期暴露組和共同暴露組Aβ含量高于成年期暴露組(P<0.05)。結論：生長期鉛暴露造成海馬組織中Aβ蓄積更嚴重，小鼠學習記憶能力的損害也更嚴重。

環境鉛暴露可增加阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)的發生風險，其致病機制尚未完全闡明[1]。β淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)是AD腦內主要病理標志性蛋白之一，它的形成、沉積和降解是AD整個病理過程的關鍵因素[2-3]。研究[4]表明，Aβ具有神經毒性，可引起神經突觸功能障礙以及神經元丟失，進而導致認知功能受損，被認為是AD的致病“元兇”。鉛對神經系統的影響與暴露年齡、暴露周期均相關[5-6]。為進一步明確鉛暴露時期對神經系統損傷的可能機制和結局，作者對生長發育期、成年期2個生命階段的小鼠進行染毒，觀察2組小鼠學習記憶能力和腦組織中Aβ含量的變化，探討鉛暴露時期在AD病變過程中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 醋酸鉛(洛陽市化學試劑廠)，水合氯醛(天津市科密歐化學試劑有限公司)，肝素鈉(國藥集團化學試劑有限公司)，Aβ1-40和Aβ1-42酶聯免疫分析試劑盒(美國IBL公司)，Morris水迷宮(北京碩林苑科技有限公司)，Z-5000石墨爐原子吸收光譜儀(日本日立公司)，Bio-Rad 680型全自動酶標儀(美國伯樂公司)，超聲波細胞破碎儀(上海京工實業有限公司)。

1.3 小鼠學習記憶能力的測定 所有實驗小鼠接受鉛暴露后飼養至出生后的第360天，用Morris水迷宮測試小鼠學習記憶能力。Morris水迷宮測試包括定位航行試驗(測試的第1～6天)和空間探索實驗(測試的第8天)。將小鼠頭朝池壁放入水中，從小鼠入水開始，記錄其找到目標平臺并在平臺上停留3 s 后的時間(即逃避潛伏期)。訓練過程中設置記錄時間為60 s，若小鼠在此時間內找不到平臺，則由實驗者將其放上平臺適應10 s。每只小鼠訓練4 次/d，連續訓練4 d。最后一次訓練結束后的第2天，按照訓練方法測試其逃避潛伏期，若在60 s 內未找到平臺，潛伏期記錄為60 s，取4 次結果的平均值，連續測定5 d。間隔1 d，第7天撤除平臺，任選一個入水點將小鼠放入水中，測量小鼠在60 s內穿越原目標平臺的次數[7-8]。

1.4 小鼠海馬組織中Aβ1-40和Aβ1-42含量的測定 學習記憶能力測試完成后次日，禁食水，稱量小鼠體重，按照0.3 mL/100 g注射100 g/L水合氯醛溶液麻醉，斷頭處死小鼠，剝離腦組織，用冰生理鹽水沖洗后，冰上快速分離出海馬組織，液氮速凍，放于-80 ℃冰箱保存。稱取海馬組織100 mg，加入500 μL預冷的PBS緩沖液于離心管中，放入冰盒中超聲破碎勻漿(變幅桿頻率設置為3次/s，定時2 min)，破碎后的勻漿液4 000 r/min離心，取上清，用ELISA試劑盒測定Aβ1-40和Aβ1-42含量。

1.5 統計學處理 采用SPSS 17.0進行分析，應用重復測量數據的方差分析比較各組小鼠平均逃避潛伏期的差異，應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較各組小鼠穿越平臺次數、海馬組織中Aβ1-40和Aβ1-42含量的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 各組小鼠平均逃避潛伏期的比較 見表1。各組小鼠不同測定時間的平均逃避潛伏期差異有統計學意義，不同組別間差異有統計學意義。

表1 各組小鼠平均逃避潛伏期的比較 s

F時間=396.688，P<0.001；F組間=177.902，P<0.001；F交互=3.194，P=0.004。

2.2 各組小鼠穿越平臺次數、海馬組織中Aβ1-40和Aβ1-42含量的比較 見表2。

表2 各組小鼠穿越平臺次數、海馬組織中Aβ1-40和Aβ1-42含量的比較

*：與對照組比較，P<0.05；△：與成年期暴露組比較，P<0.001；#：與生長期暴露組比較，P<0.05。

3 討論

在該實驗中，考慮到雌性小鼠發育成熟后，尤其是發情期，體內雌激素水平會有較大程度的提高，而雌激素對神經系統有明確的保護作用[9-10]，為了排除這種保護作用的影響，故只選擇雄性小鼠作為實驗動物。另外該研究不考慮鉛暴露的劑量效應關系，重在觀察固定鉛暴露劑量時不同鉛暴露時期對相應指標的影響，故單一選擇了2 g/L的醋酸鉛水溶液作為染鉛劑量。

Morris水迷宮測試結果顯示：與對照組相比，各鉛暴露組小鼠的學習記憶能力均有所下降，說明鉛暴露會對小鼠的學習記憶能力造成損傷，這與以往的研究[11-12]結果相一致。同時該研究結果還顯示：生長期鉛暴露對小鼠空間學習記憶能力的影響比成年期鉛暴露更嚴重，提示大腦發育早期的鉛暴露可能會對小鼠的學習記憶能力產生更為嚴重的影響。

不同神經發育階段的鉛暴露對神經系統的毒性不同，腦發育階段與成熟階段相比，對鉛暴露更為敏感。Goyer[13]發現當鉛染毒劑量和染毒時間相同時，胎兒期大鼠腦鉛含量比成年大鼠增加10倍，哺乳期大鼠增加3.5倍，而斷乳期大鼠僅增加2倍，說明腦發育期的鉛暴露更容易造成鉛在腦組織中的蓄積，而這種蓄積會對其學習記憶功能造成損害。

該研究結果顯示：與對照組相比，不論是哪個時期的鉛暴露，均會造成小鼠海馬組織中Aβ含量的升高，生長期鉛暴露的作用更顯著，提示在腦發育早期的鉛暴露更容易引起海馬組織中Aβ的蓄積。

有研究[14]發現鉛在脈絡叢中的蓄積導致了大腦中Aβ含量的顯著提高，繼而對神經系統造成損傷。Basha等[15]研究發現大鼠生長發育期鉛暴露后，淀粉樣前體蛋白(APP)基因在幼鼠腦內短時期誘發表達，在終止暴露20個月后再次發現APP高表達現象，并伴隨APP蛋白及其產物Aβ表達的上調；而晚期鉛暴露大鼠的上述基因和蛋白并無改變。有研究[16]發現腦發育期的鉛暴露可干擾隨后生命過程中APP的表達，進而影響體內Aβ的含量。由此可見，發育期的鉛暴露會引起海馬組織中Aβ含量的上升，但該研究結果只觀察了不同發育階段的小鼠在12月齡這一時間點的Aβ含量，Aβ水平升高的具體機制以及學習記憶能力的損傷是否與Aβ的蓄積存在關系尚有待進一步研究。

綜上所述，鉛暴露會導致小鼠海馬組織中Aβ的蓄積以及學習記憶能力的損害，且生長期的鉛暴露造成的蓄積更嚴重，對小鼠學習記憶能力的損害也更嚴重。這也提示兒童在生長發育期要遠離鉛暴露，避免因接觸鉛而對身體健康造成損害。

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[3]陳培,牛瑩瑩,楊曉帆.阿爾茨海默病發病中淀粉樣β蛋白的神經毒性作用[J].中國藥物經濟學,2014(2):205

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(2014-09-10 收稿 責任編輯趙秋民)

Effects of lead exposure on learning and memory ability and β-amyloid protein level in hippocampus of mice at different age stages

LIJing1)，LIUFangli2)，ANWeifeng3)，XUEZhenfei1)，LIWenjie1)

1)DepartmentofNutritionandFoodHygiene，CollegeofPublicHealth，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001 2)SchoolofNursing，HenanUniversity,Kaifeng475004 3)InstituteofHealthEducationandChronicDiseasePrevention，DiseasePreventionandControlCenterofHenan，Zhengzhou450001 4)XichengDistrictTaorantingCommunityHealthServiceCenterofBeijing,Beijing100052

lead；mouse；learning and memory ability；β-amyloid protein

Aim: To explore the effects of lead exposure on the ability of spatial learning and memory and β-amyloid protein(Aβ) level in hippocampus of mice at different age stages. Methods: Healthy male mice were randomly allocated into growing exposure group(drinking 2 g/L Pb containing water from birth to 21 days by breast milk), adulthood exposure group(drinking 2 g/L Pb containing water from 180 days to 240 days after birth), joint exposure group(lead exposed at growing period and adulthood) and control group(drinking deionized water), 10 mice in each group. After 1 year, the spatial learning and memory ability was evaluated by Morris water maze (MWM), and the level of Aβ in hippocampus was measured by ELISA. Results: The escape latency in each group measured at different days had significant difference(Ftime=396.688，P<0.001), and there were also differences between different groups(Fgroup=177.902，P<0.001). And compared with the control group, the numbers of platform cross significantly decreased(F=30.394,P<0.001). The numbers of platform cross in the growing exposure group and the joint exposure group were less than the adulthood exposure group(P<0.05). The level of Aβ in hippocampus in lead exposure groups were significantly higher than that in control group(F=346.032 and 53.796,P<0.001), and the levels of Aβ in both the growing exposure group and the joint exposure group was higher than that in the adulthood exposure group(P<0.05). Conclusion: Lead exposure can lead to the accumulation of Aβ in hippocampus and the damage of spatial learning and memory ability. These accumulation and damage are more severe when the mice get lead exposure in growing time.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.004

*國家自然科學基金資助項目 81172716

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