山葵愈傷組織誘導與增殖研究

王躍華　段茂華　任三軍　等

摘要：為了獲得山葵愈傷組織誘導和增殖的最佳培養條件，選擇山葵真葉片、真葉柄和胚軸為外植體，以MS為基本培養基，配以不同濃度的2，4-D和6-BA植物激素進行愈傷組織誘導，并將誘導的愈傷組織接種于增殖培養基中進行培養。結果表明：誘導山葵愈傷組織的最佳培養基配方為MS+4 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA，培養25 d后真葉片、真葉柄、胚軸的愈傷組織誘導率分別為（100.0±0.00）%、（60.5±3.29）%、（62.5±3.74 ）%；山葵胚軸外植體產生的愈傷組織增殖倍數最高，培養35 d后的愈傷組織增殖倍數可達（2.48±0.93）倍。

關鍵詞：山葵；愈傷組織；配方；外植體；誘導率；增殖倍數

中圖分類號： S567.23+9.043文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0053-02

收稿日期：2014-03-04

基金項目：四川省廣元市科技支撐計劃（編號：2013-25）。

作者簡介：王躍華（1963—），女，山東青島人，碩士，教授，主要從事藥用植物栽培與生藥學研究。E-mail：1961689636 @qq.com。山葵（Wasabia japonica）別稱山崳菜，為十字花科山崳菜屬多年生草本半陰生植物，原產中國和日本，被譽為“綠色黃金”[1-2]。山葵具有強烈的辛辣味及特殊的芳香，不僅具有很強的殺菌和助消化功能[3]，而且能促進淀粉性食物的消化，穩定胃腸中的維生素C和消滅消化道中的寄生蟲，具有很好的防病治病作用[4-5]。目前山葵多采用分株繁殖和種子繁殖，分株繁殖存在品種退化、繁殖系數低和種苗帶菌等問題，極易導致病害大面積發生[6]。種子繁殖具有速度快、 數量多和能部分減少病害發生的特點，但是由于山葵種子屬頑拗性種子，失水過多極易導致種子活力喪失，因此常采用低溫高濕保存；同時，山葵種子存在休眠，需有效破除休眠才能促使種子盡快萌發[7-9]。本研究采用植物組培快繁技術，通過篩選培養基配方和外植體種類，以獲得山葵愈傷組織誘導的最佳條件，為山葵后續的生物學研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

山葵種子采自四川省廣元市；試驗材料山葵植物的真葉片、真葉柄、胚軸外植體均取自山葵種子萌發所得的幼苗。

1.2試驗方法

1.2.1外植體消毒和培養選取山葵種子萌發25 d的幼苗，取其真葉片、真葉柄和胚軸外植體，將其放在超凈工作臺上用濃度為0.1 g/L的氯化汞消毒處理3 min后，用無菌水清洗5次，再用無菌濾紙吸干材料表面的水分，將其接入愈傷組織誘導培養基中。

1.2.2培養基和培養條件愈傷組織誘導培養基以MS為基本培養基，激素6-BA 的濃度均為0.5 mg/L，2，4-D 的濃度設定為0、2、4、6、8 mg/L，分別記作A1、A2、A3、A4、A5處理；在20 ℃、12 h/d的光照時長、2 000 lx的光照強度條件下培養25 d后統計各外植體的愈傷組織誘導率。

1.2.3不同外植體誘導的愈傷組織增殖選取由山葵真葉片、真葉柄、胚軸外植體誘導產生的愈傷組織，接種于MS+2 mg/L NAA +0.3 mg/L 6-BA培養基中，分別記作B1、B2、B3處理，在20 ℃、10 h/d光照時長、1 800 lx的光照強度條件下增殖培養35 d后統計其愈傷組織的增殖倍數。

1.3數據統計及計算公式

上述試驗均重復3次，數據用SPSS 13.0 統計學軟件進行方差分析，并采用新復極差（Duncans）法進行多重比較，P<0.05 為顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異，數據統計結果以“x±s”表示。愈傷組織的誘導率、增殖倍數的計算公式如下：愈傷組織誘導率=（誘導出愈傷組織的外植體數/接種的外植體數）×100%；愈傷組織的增殖倍數 = 收獲時質量/接種時質量。

2結果與分析

2.1山葵不同部位外植體的愈傷組織誘導

由表1可知，隨著2，4-D濃度增高，山葵真葉片、真葉柄、胚軸的愈傷組織誘導率均呈現先提高后降低的趨勢；其中未添加2，4-D激素的A1處理，即培養基配方為MS+0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA，均不適宜山葵各外植體的愈傷組織誘導，3 種外植體的愈傷組織誘導率均為最低，真葉片的愈傷組織誘導率為（37.5±2.73）%，真葉柄為（0.0±000）%，胚軸為（0.0±0.00）%。由此說明，在培養基中添加生長素2，4-D對山葵愈傷組織的誘導非常重要。培養基配方為MS+4 mg/L 2，4-D +0.5 mg/L 6-BA的A3處理，最適宜3種外植體的愈傷組織誘導，愈傷組織的誘導率均為最高，真葉片的愈傷組織誘導率為（100±0.00）%，真葉柄為（60.5±3.29）%，胚軸為（62.5±3.74）%。然而，隨著2，4-D濃度進一步升高到6 mg/L 以上時，山葵各外植體的愈傷組織誘導率均呈現出下降趨勢，以2，4-D濃度升高到8 mg/L 時的各外植體愈傷組織誘導率下降最為顯著，其中真葉柄外植體的愈傷組織誘導率降低了35.5百分點，表明針對不同的植物，選擇適宜的2，4-D濃度顯得尤為重要。表1山葵不同部位外植體的愈傷組織誘導

處理編號激素濃度配比（mg/L）愈傷組織誘導率（%）2，4-D6-BA胚軸真葉片真葉柄A100.50.0±0.0037.5±2.730.0±0.00A220.525.0±2.3487.5±2.1612.5 ±1.78A340.562.5±3.74100.0±0.0060.5±3.29A460.550.2±1.5787.5±1.7537.5 ±2.13A580.537.5±1.6362.5±1.2625.0±1.46

在試驗中觀察各外植體產生愈傷組織的情況，發現真葉片外植體在接種3 d后葉片開始卷曲，并且真葉片切口處開始變為嫩綠色且增厚，隨后在切口和葉脈處都開始產生黃綠色的愈傷組織；試驗中無論是將真葉片正接或反接到培養基上，愈傷組織最先在葉片的切口和與培養基接觸的一面長出淺綠色顆粒狀愈傷組織，而葉片的游離面產生愈傷組織的時間較晚，并且產生的愈傷組織顏色也多為綠色。真葉柄外植體在插入培養基中培養4 d后，其游離端出現膨大，隨后膨大明顯并脹裂表皮，接著從表皮的內層細胞長出淺黃色愈傷組織；而將真葉柄直接平放在培養基上的處理，其真葉柄是從中間開始產生膨大，最后整個葉柄膨大后也發生脹裂表皮的情況，隨后也從表皮里面產生出愈傷組織。胚軸外植體正接和反接的情況一樣，均是先從培養基上部的游離端長出黃綠色和淺黃色顆粒狀愈傷組織；而直接將胚軸平接于培養基中則是從胚軸兩端長出黃綠色愈傷組織，隨后整個胚軸愈傷化，長出愈傷組織。