靖江香沙芋組織培養快繁技術

韓曉勇　宋婷婷　王立　等

摘要：以靖江香沙芋莖尖為外植體進行快速繁殖技術研究。結果表明，75%乙醇浸泡30 s和84消毒液消毒10～15 min配合使用滅菌效果最好；芽誘導最適培養基為MS+0.5 mg/L TDZ，培養25 d后芽誘導率最高，為80%，芽高度為2.3 cm；繼代增殖最適培養基為MS+1.0 mg/L TDZ，月增殖倍數可達4.3；生根培養最適培養基為1/2MS+01 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.02%活性炭，平均生根時間為11 d，生根率達100%，根系最長為2.9 cm；生根培養45 d，將試管苗移入營養土中生長，30 d后移栽成活率達100%。

關鍵詞：靖江香沙芋；組織培養；芽誘導；快繁

中圖分類號： S632.304+.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0050-03

收稿日期：2014-03-03

基金項目：江蘇省農業科技自主創新資金[編號：CX（12）2008]。

作者簡介：韓曉勇（1983—），男，山西忻州人，碩士，助理研究員，從事特色經濟作物組織培養技術研究。E-mail：hanxy84@163.com。

通信作者：殷劍美，博士，研究員，主要從事特色經濟作物研究。Tel：（025）84390860；E-mail：yinjm2006@sohu.com。靖江香沙芋屬天南星科（Araceae）芋屬（Colocasia） 多子芋類型，是靖江市農民栽培的芋類作物當家品種。其塊莖中淀粉含量高，既可以當糧食，又可做蔬菜，是老幼皆宜的滋補品，并含有多種維生素，有一股獨特的香味。加工前景廣闊，聞名并暢銷廣西、廣東及港、澳地區。靖江香沙芋通常采用母芋留種方式進行繁殖，種性退化問題較為突出，抗病性和抗逆性減退。建立靖江香沙芋組培再生體系，不僅有利于品種的更新復壯，更可為種苗工廠化生產和新品種選育提供技術支持與儲備。

近年來，芋組織培養已相繼開展，對其莖尖和葉片等不同外植體培養進行了廣泛的研究[1-5]。但這些研究主要圍繞外植體愈傷誘導及植株再生，而愈傷誘導過程中易發生變異，不利于保持本品種的優良特性。本研究旨在建立一種從芽直接到多芽體，多芽體到試管苗的繁殖方式。這種繁殖方式不僅可以提高繁殖系數和繁殖速度，而且利于保持本品種的優良特性，可有效保護具有地方特色的種質資源。

1材料與方法

1.1材料

供試材料為靖江香沙芋芋莖尖。

1.2方法

1.2.1無菌材料的處理選取保存完好、無腐爛斑點的芋，經0.2%的K2MnO4消毒5 min后整齊排列在周轉箱中，用沙子覆蓋到整個芋塊的2/3處，放置到光照培養箱中催芽。待芽生長到1～3 cm時切取莖尖，剝除外層2～3層葉片，流動水沖洗10 min，在超凈臺上用75%乙醇浸泡30 s，分別用NaClO、84 消毒液2種消毒劑，NaClO設10、15、20 min，84消毒液設5、10、15 min 3個時間段處理滅菌，每種處理分別接種12個莖尖于MS培養基中，觀察滅菌效果。

1.2.2芽誘導分化外植體經滅菌后接種在添加不同濃度的6-BA和NAA及TDZ和IBA組合的MS培養基中，接種25 d后比較芽的分化率、芽高度及葉片數等確定適宜芽分化的培養基。激素濃度設置7個處理，每個處理設3次重復，每次重復接種15個莖尖。

1.2.3繼代增殖誘導培養基上萌發出的不定芽長到2 cm左右時，切取單芽接種在添加不同濃度的6-BA和NAA及TDZ和IBA組合的MS培養基中，30 d時觀察其增殖倍數。激素濃度設置6個處理，每個處理設3次重復，每次重復接種20個單芽。

1.2.4生根將高2.0 cm以上、帶有2張或2張以上葉的健壯小苗切下，轉入生根培養基中培養。生根基本培養基為1/2MS并添加0.02%活性炭。調查不同處理的平均生根時間，30 d的生根數、生根率、葉片數、根系平均長度及根系形態。生根培養基設置4個處理，每個處理設3次重復，每次重復接種15個小苗。

1.2.5煉苗與移栽生根培養45 d的再生苗在室外常溫下放置5 d后，打開瓶蓋煉苗1～2 d。將根系發達、株高5～12 cm 的再生苗從培養瓶中取出，洗去根部的培養基，移栽到營養土中，并置于相對濕度80%～90%、溫度20～25 ℃的環境中遮陰培養1周，2周后正常光照培養，30 d時統計成活率。

1.2.6培養基滅菌及培養條件高壓滅菌前調整培養基pH值為5.8，保持121 ℃滅菌20 min。培養室溫度為（25±2） ℃，光照度2 000～3 000 lx，每天光照12 h。培養基中瓊脂的質量分數為7 g/L，蔗糖質量分數為30 g/L。

2結果與分析

2.1不同消毒液和滅菌時間對外植體滅菌效果的影響

從表1可以看出，外植體用84消毒液滅菌10～15 min效果最好，滅菌成功率達83.3%以上。NaClO滅菌成功率遠遠低于84消毒液。

表1不同消毒液和滅菌時間對外植體滅菌效果的影響

消毒劑種類時間

（min）接種莖段數

（個）污染數

（個）污染率

（%）NaClO1012650.01512433.32012325.084消毒液512650.01012216.7151218.3

2.2芽誘導分化

從表2可以看出，MS+0.5 mg/L TDZ和MS+1.0 mg/L TDZ培養基芽誘導率及芽長勢優于另外幾種培養基。其中以MS+0.5 mg/L TDZ培養基芽誘導率最高，為80%，芽高度為2.3 cm（圖1-A）。TDZ與6-BA 2種植物生長調節劑對芋芽誘導及生長的影響差異較大，與6-BA相比，TDZ對芽分化率及株高差異都達到顯著水平，經25 d就能誘導莖尖長成2～3張葉。隨著6-BA與NAA配比濃度的提高，芽分化率呈上升趨勢，但株高及展開葉數呈下降趨勢。當 6-BA ∶NAA=4.0 ∶0.2時，葉片容易發生卷曲。表2不同激素濃度和激素種類對芽誘導的影響

激素種類及濃度接種數

（個）分化數

（個）分化率

（%）株高

（cm）展開葉數

（張）植株表現6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L154c26.7c1.4c1b芽矮小6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L153c20.0c1.3c1b芽矮小6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L157b46.7b1.8b2ab芽矮小6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L157b46.7b1.4c1b葉片卷曲TDZ 0.5 mg/L+IBA 0.0 mg/L1512a80.0a2.3a3a正常TDZ 1.0 mg/L+IBA 0.0 mg/L1511a73.3a2.3a3a正常TDZ 1.0 mg/L+IBA 0.4 mg/L158b53.3b1.7b2ab芽粗短注：同列數據后不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。表3、表4同。

2.3繼代增殖

由表3 可以看出，誘導叢生芽增殖最適宜培養基為MS+1.0 mg/L TDZ，叢生芽分化速度快，增殖倍數可達4.3（圖1-B），與其他處理差異顯著。方差分析結果顯示，TDZ對芽增效系數顯著高于6-BA。隨著6-BA與NAA配比濃度的提高，增殖系數呈先升后降的趨勢。當6-BA ∶NAA=4.0 ∶0.2 時，增殖系數和芽均較小。

2.4生根培養

由表4可以看出，不同激素濃度對組培苗生根影響較大。其中激素濃度為6-BA ∶NAA=0.1 ∶0.5時生根效果最好，平均生根時間為11 d，生根率達100%，30 d的根系長度、葉片數以及株高均顯著高于其他處理，分別為2.9 cm、3.5張和5.6 cm（圖1-C）。隨著NAA濃度增大，根系長度、葉片數和株高都有不同程度的下降，根系逐漸變短變粗，最終呈雞爪

表3不同激素濃度和激素種類對芽增殖的影響

激素種類激素濃度

（mg/L）接種數

（個）芽數

（個）增殖系數生長描述6-BA/NAA1.5/0.22034e1.7e芽較小2.0/0.22042d2.1d芽較大4.0/0.22032e1.6e芽很小TDZ/IBA0.5/0.02078b3.9b正常1.0/0.02086a4.3a正常1.0/0.42075c3.75c易生根

狀，并伴有少量氣生根出現。組培苗培養45 d左右（圖1-D）移入苗床營養土中，15 d后開始長出新葉，30 d時成活率達100%（圖1-E）。

3討論

TDZ（苯基噻二唑基脲）是一種人工合成的苯基脲重氮噻唑取代衍生物。Mok等首次發現TDZ有很強的細胞分裂素活性，濃度很低的TDZ能促進利馬豆（lima bean）愈傷組織生長[6]。Chand等發現，在芋莖尖分生組織培養中，與BA相表4不同激素濃度對生根的影響

NAA

（mg/L）6-BA

（mg/L）接種數

（個）生根時間

（d）生根苗數

（苗）生根率

（%）平均根長

（cm）葉片數

（張）株高

（cm）植株表現0.50.1151115100a2.9a3.50a5.6a細長1.00.1151315100a1.7b2.80b3.4b粗短2.00.1151315100a1.2c2.25c2.8c雞爪狀，氣生根4.00.1151315100a1.0c2.50bc2.9c雞爪狀，氣生根

比，MS培養基中添加一定濃度的TDZ可以增強外植體的活力[7]。本試驗結果表明，與6-BA相比，TDZ更適于促進芋莖尖萌動、生長及叢生芽增殖，與崔瑾等得出的TDZ在不同基因型芋組織培養的生理效應和TDZ對莖尖生長的影響結論[8-9]一致。適宜靖江香沙芋芽分化的培養基為MS+0.5～1.0 mg/L TDZ，其中以MS+0.5 mg/L TDZ的培養基芽誘導率和芽的高度方面表現最好；叢生芽增殖最適宜培養基為MS+1.0 mg/L TDZ，叢生芽分化速度快，增殖倍數可達4.3。林文麗等在海門香沙芋的組織培養中認為TDZ與IBA適當濃度配比有利于叢生芽的增殖[2]，本試驗結果表明，添加IBA反而利于組培苗生根，形成差異的原因可能與品種的基因型有關。

在一定濃度范圍內，提高NAA濃度有利于試管苗生根。但NAA濃度不能太高，當NAA濃度高于2.0 mg/L時，根系長度、葉片數和株高都出現不同程度的下降，說明高濃度NAA對試管苗的生長產生抑制作用，這種抑制作用隨著NAA濃度的升高而越加明顯[10]。外植體在培養過程中體內的多酚氧化酶被激活，使細胞里的酚類物質氧化成棕褐色的醌類物質，有時使整個培養基變褐，從而抑制其他酶的活性，影響材料的培養。在培養基中加入0.02%的活性炭抗氧化吸附，并勤換培養基可以減少褐化[11]。

本研究中靖江香沙芋莖尖離體培養過程中產生叢芽但未見愈傷組織的產生，這種直接通過“芽生芽”的方式獲得與親本類似的幼苗，可以減少變異的可能，有效保護具有地方特色的種質資源，這與張曉蘭等的觀點[4]一致。

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