新疆南疆地區(qū)微小牛蜱Bm86基因克隆及鑒定

代艷艷　廖秋萍　賈桂珍　等

摘要：為了克隆及鑒定新疆南疆地區(qū)微小牛蜱Bm86基因，參照GenBank登錄的微小牛蜱Bm86基因序列，設(shè)計(jì)了可以擴(kuò)增Bm86基因完整閱讀框架的引物，對(duì)微小牛蜱進(jìn)行總RNA提取、RT-PCR、克隆、測(cè)序、序列分析。結(jié)果表明，獲得的Bm86基因長(zhǎng)1 953 bp，與GenBank中登錄號(hào)為M29321、HQ014398的微小牛蜱Bm86基因核苷酸同源性分別為99%、97%，且為一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框架。本研究獲得的微小牛蜱Bm86基因，為獲得基因工程疫苗的候選抗原及中國(guó)抗微小牛蜱疫苗制備奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：南疆；微小牛蜱；Bm86基因；克隆

中圖分類號(hào)： S852.74+6文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）01-0024-03

收稿日期：2014-02-21

基金項(xiàng)目：新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)博士資金（編號(hào)：2012BB023）；塔里木大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（編號(hào)：2013107570030）。

作者簡(jiǎn)介：代艷艷（1994—），女，河南鹿邑人，研究方向?yàn)閯?dòng)物傳染病與免疫病理學(xué)。E-mail：2275781936@qq.com。

通信作者：趙麗，博士，副教授，主要從事動(dòng)物疫病研究。E-mail：zhaolidky@126.com。微小牛蜱為典型的一宿主蜱，是我國(guó)分布最廣的一個(gè)種[1]，屬于蜱類最常見(jiàn)、危害最大的硬蜱科扇頭蜱亞科扇頭蜱屬[2]。該蜱主要生活于農(nóng)區(qū)，在新疆喀什及周邊地區(qū)多見(jiàn)。該蜱主要寄生于牛，也常寄生于其他家畜和野生動(dòng)物，也侵襲人類。可引起動(dòng)物貧血、消瘦、發(fā)育不良、產(chǎn)乳量下降或肢體麻痹，更重要的是感染動(dòng)物免疫抑制，使蜱更易于存活或傳播疾病。在我國(guó)，微小牛蜱是其他許多寄生蟲(chóng)的傳播媒介和傳播者，也能自然感染一些人畜共患病等[3]。因此做好微小牛蜱及其蜱傳病的防治工作，對(duì)新疆乃至全國(guó)畜牧業(yè)健康發(fā)展意義重大。

微小牛蜱Bm86是Willadsen等[4-5]從半飽血微小牛蜱雌蜱腸道分離的一種膜結(jié)合糖蛋白，是一種較好的保護(hù)性抗原。Penichet等證實(shí)，Bm86抗原在不同株的微小牛蜱腸道細(xì)胞膜上均存在，重組Bm86表達(dá)產(chǎn)物對(duì)抗藥性微小牛蜱也有免疫抵抗作用[6]。García-García等研究發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌中Bm86基因表達(dá)的產(chǎn)物為融合蛋白包涵體，用該包涵體免疫的牛對(duì)微小牛蜱具有明顯的抵抗力[7]。李文卉等將Bm86基因進(jìn)行真核表達(dá)獲得了其重組蛋白[8]；樊瑞泉等[9]、馬米玲等[10]將Bm86基因克隆到原核表達(dá)載體pGEX-4T-1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后得到能被兔抗微小牛蜱全蜱陽(yáng)性血清所識(shí)別的包涵體。

蜱的防治已成為國(guó)內(nèi)外畜牧業(yè)發(fā)展迫切須要解決的課題，傳統(tǒng)蜱防治方法造成的環(huán)境污染、食品安全、藥物殘留、抗藥性等問(wèn)題日趨嚴(yán)重。免疫防治可使宿主增強(qiáng)免疫力，針對(duì)性地消滅特定蜱種，污染極低，有利于環(huán)境保護(hù)和人類健康，最主要的是可使易感動(dòng)物具有一定抵抗力，有助于蜱種群和蜱傳病的控制[11-12]，是有效防治蜱及蜱傳病的一個(gè)研究方向。抗蜱疫苗在蜱類防治中具有很大的潛力，比傳統(tǒng)化學(xué)防治更有應(yīng)用前景。目前，以基因工程手段研制疫苗是抗蜱疫苗的主要方向[13]。抗蜱疫苗的成功研制，首先在于調(diào)節(jié)其生理作用的有效功能性抗原的鑒定、識(shí)別及作為高效重組體的表達(dá)。本研究針對(duì)新疆南疆地區(qū)優(yōu)勢(shì)蜱種微小牛蜱，對(duì)其Bm86基因完整閱讀框架進(jìn)行克隆，以期為后續(xù)該基因的表達(dá)、免疫抗原制備和抗微小牛蜱疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1微小牛蜱采自喀什地區(qū)牛和阿克蘇地區(qū)羊。

1.1.2菌種和主要試劑宿主菌E.coli DH5α由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。Trizol invitrogenTM（Code No.：15596-026），購(gòu)自Invitrogen生物工程有限公司；TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0（Code No.：DRR019A），Premix TaqTM Version 2.0（Code No.：D331A）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；TIANgel Midi Purification Kit（Code No.：DP209）、TIANprep Mini Plasmid Kit（Code No.：DP103）、pGM-T克隆試劑盒（Code No.：VT202）、D2000 DNA Marker（Code No.：MD114）均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；IPTG、X-Gal、Gold view、6×Loading Buffer、氨芐青霉素、無(wú)水氯化鈣、氯仿、無(wú)水乙醇等試劑，均購(gòu)自北京金泰博達(dá)生物科技有限公司。

1.1.3引物按照引物設(shè)計(jì)原則，利用Primer Premier 5.0分子生物學(xué)軟件，以GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中微小牛蜱Bm86基因全序列為模板，設(shè)計(jì)擴(kuò)增Bm86基因完整閱讀框架的特異性引物，P1：5′-ATGCGTGGCATCGCTTTGTTCG-3′，P2：5′-TTACAACGATGCTGCGGTGACTG-3′，預(yù)期擴(kuò)增大小為1 953 bp，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.1.4儀器PCR儀（TC-5000，Bibby scientific Ltd）、小型高速冷凍離心機(jī)（R134a，Hermetically sealed refigeration system）、電泳儀（DYY-12，北京市六一儀器廠）、紫外分析儀（JY02S，北京君意東方電泳儀設(shè)備有限公司）等。

1.2方法

1.2.1總RNA提取以微小牛蜱為材料，按Trizol invitrogenTM試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA。

1.2.2RT-PCR反應(yīng)總RNA按照TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒，利用已設(shè)計(jì)的特異性引物P1、P2擴(kuò)增Bm86基因，退火溫度58 ℃。

1.2.3PCR產(chǎn)物純化回收取Bm86基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳切膠后，按照TIANgel Midi Purification Kit試劑盒說(shuō)明進(jìn)行回收純化。

1.2.4純化產(chǎn)物連接T載體膠回收純化的目的Bm86基因產(chǎn)物，按照pGM-T克隆試劑盒說(shuō)明操作與pGM-T載體連接。

1.2.5DH5α感受態(tài)細(xì)胞制備DH5α受體菌，37 ℃培養(yǎng)收集菌液，采用CaCl2法制備DH5α感受態(tài)細(xì)胞，新鮮即可使用，或-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞、鑒定、搖菌提取質(zhì)粒及測(cè)序?qū)⑦B接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化自制的DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。白色菌落按照Premix TaqTM Version 2.0試劑盒說(shuō)明，利用自行設(shè)計(jì)的P1、P2引物進(jìn)行菌落PCR鑒定；挑取PCR陽(yáng)性菌落接種液體培養(yǎng)基搖菌，按照TIANprep Mini Plasmid Kit試劑盒說(shuō)明提取質(zhì)粒DNA，標(biāo)記后送生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序，測(cè)序引物為T(mén)7。保存陽(yáng)性菌和質(zhì)粒。

1.2.7序列分析測(cè)序結(jié)果用BLAST在線平臺(tái)分析與其核苷酸同源性最高的序列。

2結(jié)果與分析

2.1Bm86基因RT-PCR擴(kuò)增

以微小牛蜱為材料提取總RNA，一步法RT-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出大小約1 953 bp的特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。

2.2菌落PCR鑒定

挑取7個(gè)白色菌落，利用P1、P2引物進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果均為陽(yáng)性（圖2）。

2.3測(cè)序分析

將微小牛蜱經(jīng)RT-PCR、克隆、測(cè)序所得Bm86基因序列，長(zhǎng)度為1 953 bp。利用BLAST在線平臺(tái)分析，顯示與其核苷酸同源性較高的前2個(gè)序列GenBank登錄號(hào)為M29321、HQ014398，核苷酸同源性分別是99%（1 926/1 953 bp）、97%（1 901 bp/1 953 bp），已登錄的這2個(gè)序列基因均來(lái)源于微小牛蜱。本研究測(cè)序得到的序列為一個(gè)完整開(kāi)放閱讀框架。測(cè)得Bm86基因序列見(jiàn)圖3。

3結(jié)論與討論

微小牛蜱Bm86是Willadsen等[4-5]從半飽血微小牛蜱雌蜱腸道分離的一種膜結(jié)合糖蛋白，是一種較好的保護(hù)性抗原。當(dāng)微小牛蜱吸食用其免疫的牛血液時(shí)，血液中的抗體與蜱腸道表面相應(yīng)糖蛋白結(jié)合，從而使蜱腸道受到嚴(yán)重?fù)p傷，當(dāng)牛血

液滲入蜱血淋巴后，能進(jìn)一步引起蜱的大規(guī)模死亡以及繁殖、生存能力下降等。本研究從新疆南疆地區(qū)微小牛蜱體內(nèi)成功克隆了Bm86基因，長(zhǎng)度為1 953 bp，與預(yù)期一致，為一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框架，其核苷酸序列與GenBank中登錄號(hào)為M29321、HQ014398的微小牛蜱Bm86基因核苷酸同源性分別為99%、97%，說(shuō)明該基因也存在于我國(guó)微小牛蜱體內(nèi)。

雖然已證實(shí)Bm86基因?qū)ξ⑿∨ｒ缑庖弑Ｗo(hù)作用良好，但天然Bm86基因抗原在微小牛蜱體內(nèi)含量少，難以獲得，所以Bm86基因重組蛋白的獲得及其是否具備免疫原性至關(guān)重要。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者利用原核表達(dá)和真核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行了表達(dá)[7-10]。但基因表達(dá)水平與許多因素有關(guān)，筆者擬用含有CMV強(qiáng)啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的pVAXl高效真核表達(dá)載體對(duì)其進(jìn)行表達(dá)，構(gòu)建DNA疫苗。因此，獲得一個(gè)完整閱讀框架的Bm86基因至關(guān)重要，本研究中Bm86基因的獲得、測(cè)序、鑒定工作已完成，且基因變異小，序列保守，適合作為基因工程疫苗的候選抗原，對(duì)制備抗微小牛蜱疫苗具有重要價(jià)值。

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