金蕎麥—表兒茶素類活性物質體外抑菌試驗

黃仁術　易凡

摘要：為了探討金蕎麥（Fagopyrum dibotrys）提取液的抑菌效果，試驗測得其乙醇提取液中（-）表兒茶素類活性物質含量達到10.019 mg/mL，占其塊根干物質重的1.85%；牛津杯法表明金蕎麥（-）表兒茶素類活性物質對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、大腸桿菌均有抑制作用，但對黑曲霉、灰綠青霉沒有抑制作用；二倍稀釋法表明（-）表兒茶素類活性物質對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母的MIC分別為1.252、2.505、5010、5.010 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的MBC為5.010 mg/mL。

關鍵詞：金蕎麥；（-）表兒茶素；體外抑菌

中圖分類號： S482.2+92文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0308-03

收稿日期：2014-02-18

基金項目：安徽省高校省級自然科學研究重點項目（編號：KJ2012A280）；國家級大學生創新創業訓練計劃（編號：201210376004）。

作者簡介：黃仁術（1976—），女，新疆阿克蘇人，碩士，副教授，主要從事天然活性物質研究。E-mail：ahhrs@126.com。植物是抑菌活性物質的天然寶庫，Grange等報道約有2 400種植物具有防治有害生物的活性[1]。金蕎麥（Fagopyrum dibotrys）作為一種具有開發前途的資源植物，目前有關其抑菌方面的研究較少，且未涉及具體的抗菌活性物質成分。如有關文獻報道金蕎麥乙醇提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈球菌、沙門氏菌等有抑制作用[2-5]；而陳福勇等發現金蕎麥乙醇提取物對雞白痢沙門氏菌、金黃色葡萄球菌有較好的抑菌作用，對大腸桿菌無抑制作用[6]；張永仙等則報道金蕎麥乙醇提取物對豬霍亂沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌、豬與雞的致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、豬鏈球菌、克氏肺炎球菌等幾乎無抗菌作用，但在體內卻有明顯的抗感染作用[7]。實際上，金蕎麥乙醇提取物為一類含原花色素的縮合性單寧混合物，主要由（-）表兒茶素及其二聚體組成，其中（-）表兒茶素單元的含量占65%～70%[8]。為此，本研究對金蕎麥乙醇提取物——（-）表兒茶素類活性物質的含量進行測定，并在此基礎上確定其對一些代表性細菌和真菌的抗菌效果，從而為無殘留、無毒副作用及細菌不易產生耐藥性的抗菌藥物開發奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

金蕎麥采集于安徽省潛山縣；（-）表兒茶素純度為98% （中國藥品生物制品檢定所）；試驗菌株包括革蘭陽性菌、革蘭陰性細菌和真菌，其中革蘭陽性細菌以金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）為代表，革蘭陰性菌以大腸桿菌（Escherichia coli）為代表，真菌以黑曲霉（Aspergillus niger）、灰綠青霉（Penicillium glaucum）、釀酒酵母（Saccharomyces carlsbergensis）為代表；牛肉膏蛋白胨培養基，PDA培養基。

1.2儀器設備

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司），202-1型電熱恒溫干燥箱（上海浦東英豐科學儀器有限公司），HH-2/HH-4數顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司），YX-450電熱蒸汽壓力消毒器（上海三申醫療器械有限公司），PYX-150HA恒溫恒濕培養箱（科立儀器），SW-CJ-1C潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）。

1.3試驗方法

1.3.1金蕎麥（-）表兒茶素類活性物質的提取與測定建立香莢蘭素-鹽酸分光光度法對（-）表兒茶素類活性物質含量的測定標準曲線：D=0.226 2C-0.012 6，R=0999 3，其中，D為吸光度，C為測定液濃度（μg/mL）。稱取20.0 g金蕎麥根部粉碎物，70%乙醇浸泡24 h，提取物用布氏漏斗抽濾提取得到上清液，上清液繼續用旋轉蒸發儀旋轉蒸發得到濃縮提取液，直至冷凝裝置不再有液體滴出，倒出提取液，量出為37 mL，封口冷藏保存。提取液測定時，用移液槍取10 μl提取液和10 mL乙醇于50 mL容量瓶中，用1%香莢蘭-濃鹽酸定容，測定吸光度，根據標準曲線計算測定液中（-）表兒茶素類活性物質的濃度[9]，試驗重復測定3次。

1.3.2供試菌株的復蘇與純化無菌條件下用接種環接種金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基，37 ℃條件下培養 1 d。接種釀酒酵母、黑曲霉、灰綠青霉于PDA培養基，28 ℃條件下培養3 d。再用接種環挑取單個菌落接種培養，如此重復4次，得到純種菌體。用接種鏟刮下純種菌體，無菌水稀釋備用。

1.3.3牛津杯法測定（-）表兒茶素類活性物質抑菌效果在倒好的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基上分別加入100 μL金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌菌液，在PDA培養基上分別加入100 μL釀酒酵母、黑曲霉、灰綠青霉菌液，涂抹均勻。用鑷子夾取已經滅菌的牛津杯置于平板中央，用已滅菌的移液槍移取200 μL濃縮物加入牛津杯中。細菌在37 ℃條件下培養1 d，真菌在28 ℃條件細培養3 d，觀察并測量抑菌圈。

1.3.4（-）表兒茶素類活性物質的MIC、MBC測定每組取滅菌小試管10支，按照1～10編號，細菌每管加入牛肉膏湯1 mL，真菌每管加入馬鈴薯葡萄糖液1 mL；采用二倍稀釋法，用吸管吸取提取液 1 mL放入第1管，并反復吹勻；接著從第1管吸出1 mL放入第2管同樣吹勻后吸出1 mL放入第3管，依次逐管進行稀釋到第8管；然后各管加入0.5 mL供試菌菌液。第9管為加入1 mL提取液但不加菌液的陰性對照管，第10管為不加提取液只加0.5 mL供試菌菌液的陽性對照管。細菌在37 ℃條件下培養1 d，真菌在28 ℃培養3 d，根據各管菌液生長情況測定最低抑菌濃度（MIC）。endprint

進一步將未見細菌或真菌生長的各試管內的培養液移種到牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基或PDA培養基上，細菌在37 ℃條件下培養1 d，真菌在28 ℃條件下培養3 d，根據培養皿中菌落生長情況測定最小殺菌濃度（MBC）。

2結果與分析

2.1金蕎麥（-）表兒茶素類活性物質的含量

由表1可見，金蕎麥的乙醇提取物經旋轉蒸發濃縮后，其（-）表兒茶素類活性物質含量達到10.019 mg/mL，總提取量占其塊根干物質質量的1.85%。

表1金蕎麥（-）表兒茶素類活性物質含量測定情況

重復測定液吸光度測定液中活性物質

含量（μg/mL）提取液中活性物質

含量（mg/mL）Ⅰ0.4391.9969.982Ⅱ0.440 2.00110.004Ⅲ0.443 2.01410.071平均0.4412.00410.019

2.2（-）表兒茶素類 活性物質抑菌效果

由圖1可知，金蕎麥（-）表兒茶素類活性物質在10.019 mg/mL濃度時對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、大腸桿菌均形成抑菌圈，表明有明顯的抑菌作用；但對黑曲霉、灰綠青霉沒有形成抑菌圈，表明沒有抑菌作用。進一步測量表明，相同濃度下，金蕎麥（-）表兒茶素類活性物質對上述菌群的抑菌圈直徑為：金黃色葡萄球菌>釀酒酵母>枯草芽孢桿菌>大腸桿菌（表2）。

2.3（-）表兒茶素類活性物質的MIC、MBC

從表3中可知，金蕎麥（-）表兒茶素類活性物質對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度（MIC）為1.252 mg/mL，最小殺菌濃度（MBC）為5.010 mg/mL；對大腸桿菌的MIC為 2.505 mg/mL，對枯草芽孢桿菌、釀酒酵母的MIC為 5.010 mg/mL。

3討論

金蕎麥乙醇提取物原液——（-）表兒茶素類活性物質含量在10.019 mg/mL濃度時，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、大腸桿菌有抑菌作用，對黑曲霉、灰綠青霉沒有抑制作用。（-）表兒茶素類活性物質對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母的MIC分別為1.252、2505、5.010、5.010 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的MBC為5010 mg/mL；因提取液原液的濃度關系，未測定出大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母的MBC。金蕎麥（-）表兒茶素類活性物質的抑菌活性不同，主要原因是活性成分對不同菌種的菌絲或孢子的生長抵制能力不同所致[10]。同時，試驗結果與前人對金蕎麥乙醇提取物的抑菌情況報道不一，可能與提取液中的活性物質濃度不同相關。

香莢蘭素比色法測定（-）表兒茶素時，所測物質應包括（-）表兒茶素、（+）兒茶素，以及二者的二聚體和沒食子酸酯等（-）表兒茶素類物質總含量[11]。此類含原花色素的縮合性單寧混合物可以通過結合細菌細胞壁蛋白質，聚集細胞脂質，以及單寧自氧化產生過氧化氫，干擾細菌細胞膜的通透性，進一步改變細菌細胞壁脂肪酸的組成，從而減緩細菌的生長[12]。

表2金蕎麥（-）表兒茶素類活性物質對供試菌的抑菌圈的影響

供試菌抑菌圈直徑（mm）金黃色葡萄球菌13枯草芽孢桿菌10釀酒酵母12大腸桿菌9黑曲霉-灰綠青霉-注：“-”表示未見明顯抑菌圈。

表3金蕎麥（-）表兒茶素類活性物質的MIC、MBC

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