CUEDC2在肝細胞癌組織中的表達及其臨床預后的意義*

王伯慶， 薛 峰， 丁 偉△， 唐建軍， 康鐵邦， 毛拉艾沙·買買提， 李海軍， 唐津天， 董曉剛， 尹繼煒， 依馬木買買提江·阿布拉， 易 超， 徐 林， 佟 慶， 張國慶△

(1新疆醫科大學附屬腫瘤醫院肝膽胰外科，新疆 烏魯木齊 830011； 2華南腫瘤學國家重點實驗室，中山大學腫瘤防治中心，廣東 廣州 510060)

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CUEDC2在肝細胞癌組織中的表達及其臨床預后的意義*

王伯慶1， 薛 峰1， 丁 偉1△， 唐建軍2， 康鐵邦2， 毛拉艾沙·買買提1， 李海軍1， 唐津天1， 董曉剛1， 尹繼煒1， 依馬木買買提江·阿布拉1， 易 超1， 徐 林1， 佟 慶1， 張國慶1△

(1新疆醫科大學附屬腫瘤醫院肝膽胰外科，新疆 烏魯木齊 830011；2華南腫瘤學國家重點實驗室，中山大學腫瘤防治中心，廣東 廣州 510060)

目的： 檢測含CUE結構域蛋白2(CUEDC2)在肝細胞癌組織中的表達，探討其與臨床預后的關系。方法： 選取具有完整臨床及預后資料的186例手術切除肝細胞癌組織的石蠟組織標本，采用免疫組化技術檢測CUEDC2的表達，并結合肝癌臨床病理因素及預后進行分析。結果： CUEDC2在85.5% (159/186)的肝癌組織中有表達, 其中低表達為52.2%(97/186)，高表達為47.8% (89/186)；CUEDC2的表達狀態與血清甲胎蛋白(AFP)水平、腫瘤大小、腫瘤數目、肝癌分化程度和TNM分期有關(P<0.05)。Kaplan-Meier生存分析顯示CUEDC2高表達的患者術后總生存及無復發生存期較低表達者顯著縮短;多因素Cox回歸分析顯示CUEDC2的表達狀態、血清AFP和腫瘤數目是影響肝癌患者術后無復發生存(RFS)及總生存期(OS)的獨立危險因素。結論： CUEDC2在多數肝癌組織中有表達，與腫瘤的生長、分化及預后有關；CUEDC2可以作為一個有價值的肝癌預后預測的新指標。

肝腫瘤； 肝切除術； CUEDC2蛋白； 預后

原發性肝癌是最常見的消化系統腫瘤之一，發病率在全球惡性腫瘤中位居第五，死因位居第三，全球每年新發病例中約50%來自中國[1]。肝細胞癌(以下簡稱肝癌)占原發性肝癌的91.5%，由于其惡性程度高，對放化療不敏感，肝癌術后的總體5年生存率僅30%～50%。影響肝癌發生發展及預后的因素是多方面的，其中細胞周期異常被認為在肝癌的發生發展中起著重要的作用[2]。因此，檢測肝癌組織中調節細胞周期的關鍵蛋白，可能對肝癌預后判斷提供有意義的信息。

含CUE結構域蛋白2(CUE domain-containing 2,CUEDC2)是一個重要的細胞周期調節分子，同時還具有調控炎癥、免疫、腫瘤耐藥等重要功能[3]。CUEDC2廣泛表達于許多真核細胞，并且在乳腺癌、卵巢癌、腎癌等多種腫瘤組織中呈異常高表達，促使細胞有絲分裂異常和基因組不穩定，是腫瘤發生、發展密切相關因素[4]。然而，在結腸癌組織中的巨噬細胞，卻幾乎檢測不到CUEDC2表達，這種表達缺失導致結腸黏膜遭受過度炎癥刺激而最終發生腫瘤[5]。因此，以上提示CUEDC2在不同腫瘤中表達定位及發揮的作用可能不同。目前，CUEDC2與肝癌的研究尚未見報道，我們感興趣的是CUEDC2在肝癌組織中的表達，并初步探討其與臨床病理因素間的關系及預后預測價值。

材 料 和 方 法

1 臨床資料

收集新疆醫科大學附屬腫瘤醫院肝膽胰外科2002年1月至2004年3月行手術切除的肝細胞癌患者的石蠟標本186例，所有蠟塊組織均取材于肝癌與癌旁組織交界區。所有患者具有完整存檔病歷和隨訪資料。186例肝癌患者中，男性165例，女性21例，年齡28～76歲，中位年齡52歲，所有患者術前均未接受放、化療等抗腫瘤治療，治療方式均為根治性手術切除。按照入選標準，連續性選擇本組肝癌患者。另外，收集手術切除的新鮮組織樣本，分別取材于肝癌及距腫瘤2 cm的非腫瘤肝組織，立即凍存于-80 ℃冰箱備用。

2 主要實驗方法

2.1 免疫組化染色 所有經手術切除組織標本，用10%甲醛固定，常規脫水并石蠟包埋，制成4 μm組織切片，經HE染色病理證實的肝癌，進一步做免疫組化染色。組織玻片于溫熱的二甲苯溶液充分脫蠟后，分別于梯度乙醇中浸泡水化；3%H2O2孵育，以阻斷內源性過氧化物酶；切片放入檸檬酸鹽緩沖液中，微波加熱修復抗原；滴加非免疫性山羊血清(Beyotime)，室溫封閉30 min；滴加兔抗人CUEDC2特異性抗體(Abcam, 1∶400)，4 ℃過夜；PBS沖洗，滴加HRP II抗(Genetech, 500710)，37 ℃孵育30 min；PBS沖洗，DAB顯色；蘇木精復染細胞核，二甲苯透明，中性樹脂封片。用已知染色強陽性的組織切片作為陽性對照，用山羊血清代替Ⅰ抗作為陰性對照，PBS代替Ⅰ抗作為空白對照。血管侵犯的判斷標準：肝癌的HE染色組織切片，在光學顯微鏡下觀察，在肝臟靜脈或腫瘤包膜的靜脈內出現癌栓。多發腫瘤是指腫瘤數目在2個或2個以上，但仍局限于肝臟的一半、一葉或一段內，可以是多原發，也可以是衛星結節。

2.2 免疫組化染色結果評分標準 根據陽性細胞所占比例和染色深度進行綜合評分。CUEDC2蛋白主要定位于細胞質，在組織切片中胞質染為高于背景的淡黃、棕黃、黃褐色者為陽性反應細胞。細胞無顯色為0分;淡黃色為1分；棕黃色為 2分；黃褐色為3分。每張切片隨機選擇5個視野，每個視野計數100個細胞，得出陽性細胞百分比并賦分：無陽性細胞為0分， 10%～30%為 1分，31%～50%為 2分，>50%為3分。每例的最終染色評分值為上述2個評分的乘積。按評分高低分級，≤6分為低表達，>6分為高表達。以上結果均由2位病理專科醫師獨立閱片并評分。

2.3 Western blotting檢測 分別收取手術切除的肝癌與癌旁非腫瘤肝組織樣本，提取總蛋白后，取等量樣品加入考馬斯亮藍的Bradford工作液充分反應后，用多功能酶標儀檢測計算蛋白濃度，取等量蛋白20 μg，用10% SDS-PAGE分離，將蛋白轉至PVDF膜，用β-tubulin抗體(Cell signal technology, 1∶10 000)作為內參照，將膜放入5%的脫脂奶粉中室溫搖床封閉2 h，目的條帶加CUEDC2Ⅰ抗(Abcam，1∶600)放入冰箱4 ℃孵育過夜。用TBST洗膜后，用HRP偶聯的Ⅱ抗(Promega，1∶10 000)，室溫孵育1 h。TBST洗膜后，在暗房顯影，X光片壓片后，沖洗膠片。

2.4 無復發生存期及總體生存期評定與隨訪 生存時間按月計算，自手術切除腫瘤日至診斷腫瘤復發或患者死亡為無復發生存期(recurrence-free survival, RFS)，總生存期(overall survival, OS)為手術當日至死亡日或最近一次隨訪。本研究中共入組186例接受肝癌根治性切除患者，術后定期隨訪，采用病歷跟蹤、電話隨訪及信件隨訪的方式，綜合臨床體征、影像學檢查(B超、CT或MRI等)以及 甲胎蛋白(alpha-fetal protein, AFP)結果，提示肝臟或遠處器官出現新病灶，即診斷為腫瘤復發。隨訪截止日期為2011年 9月30日，中位隨訪時間45個月(3～105 個月)，無失訪。死因均由肝腫瘤本身所致。

3 統計學處理

運用SPSS 16.0軟件進行統計分析。CUEDC2蛋白表達與臨床病理因素的關系采用2檢驗或Fish確切概率法檢驗，采用Kaplan-Meier法的log-rank檢驗計算比較累積生存率，Cox回歸模型進行單因素及多因素生存分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 CUEDC2蛋白在肝癌及癌旁肝組織中的表達

Western blotting實驗顯示CUEDC2蛋白在肝癌組織的表達較癌旁肝組織的表達呈現增高趨勢，見圖1。免疫組化檢測的結果顯示，CUEDC2在85.5%(159/186)的肝癌組織中有表達, 其中低表達為52.2% (97/186)，高表達為47.8% (89/186)。肝癌組織中CUEDC2蛋白表達主要定位于細胞漿，細胞漿中表現為存在不同染色深度的黃色顆粒，隨著肝癌細胞分化級別的降低，CUEDC2蛋白表達呈現上調趨勢，見圖2。癌旁肝組織中CUEDC2亦有表達，且主要位于肝細胞漿中，多呈淡黃色弱陽性表達。僅在少數病例的肝癌及癌旁肝組織中可見CUEDC2陽性信號入核。

Figure 1.CUEDC2 expression was detected in clinical tissue specimens. Western blotting indicated that CUEDC2 protein level was higher in tumor tissues (T) than that in non-tumor counterparts (N). β-tubulin was used as the loading control.

2 CUEDC2蛋白表達與肝癌患者各臨床病理因素間的關系

由表1可見，CUEDC2蛋白表達狀態與術前血清AFP 水平、腫瘤直徑、腫瘤數目、腫瘤分化程度和TNM分期有關(P<0.05)，但與肝癌患者的性別、年齡、乙肝的感染狀態、有無肝硬化和有無血管侵犯等臨床病理因素無明顯關系(P>0.05)。

Figure 2.HE (×200) and corresponding IHC (×200) staining images of CUEDC2 protein from 4 patients (A, B, C and D). Grades of HCC differentiation (Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ and Ⅳ) was identified according to Edmonson Steiner method. A: negative staining was well differentiated; B: weak staining was moderately differentiated; C: moderately staining was poorly differentiated; D: strong staining was undifferentiated. CUEDC2 was detectable in cytoplasm of HCC,and the intensities of cytoplasmic CUEDC2 signal of HCC specimens were scored as 4 grades (3, 2, 1, 0) as indicated. The positive cells were stained brown.

3 肝癌預后影響因素的單因素和多因素分析

本研究共引入11項可能影響肝癌患者術后生存的臨床病理因素，包括患者性別、年齡、乙肝病毒感染狀態、術前血清AFP 水平、有無肝硬化、腫瘤大小、腫瘤數目、腫瘤分化程度、血管侵犯和TNM分期。Cox單因素分析結果顯示，術前血清AFP水平、腫瘤大小、腫瘤數目、腫瘤分化級別、TNM分期和CUEDC2表達水平均顯著影響患者術后總體生存期與無復發生存期(P<0.05)，見表2。將上述單因素分析得出的對肝癌患者預后有意義的因素引入Cox回歸模型，進行多因素分析，結果提示，術前血清AFP、腫瘤數目和CUEDC2蛋白表達狀態均是影響患者術后總體生存期及無復發生存期的獨立預后因素(P<0.05)，見表3。

4 生存分析(Kaplan-Meier法)

根據CUEDC2蛋白表達水平繪制總生存及無復發生存曲線。 CUEDC2蛋白高表達者術后5年的累積總生存及無復發生存率均顯著低于低表達者(P<0.05)。見圖3。

表1 CUEDC2在186例手術切除的肝癌中的表達與臨床病理參數的關系

HCC: hepatocellular carcinoma; HBsAg: hepatitis B surface antigen; AFP: α-fetal protein; TNM: tumor-node-metastasis;aAccording to 6th edition AJCC/ UICC TNM stage system, no patients in stage Ⅳ.

討 論

目前，AFP仍是肝癌重要的診斷及預后預測標記物，但臨床上有40%的小肝癌患者AFP呈現假陰性[6]，因此，尋找更多有價值的肝癌診斷、預后標志物具有重要的臨床意義[7-8]。

CUEDC2是一個與多種腫瘤有關的新蛋白，在腫瘤中的功能研究包括腫瘤形成和對腫瘤的治療反應等方面，具體包括細胞周期、炎癥和類固醇受體等。它的CUE功能結構域是一個中度保守的泛素結合結構，參與泛素蛋白酶體途徑，促進蛋白質分子的泛素化與降解。基因敲低實驗發現，敲低CUEDC2可導致細胞有絲分裂后期發生的延遲[9]。Zhang等[10]發現，CUEDC2可通過控制炎癥因素激活的NF-κB信號強度，完成機體對炎癥反應的精確調控，避免炎癥過度反應并損傷自身組織。原發性肝癌多數是在病毒性肝炎長期感染炎癥刺激下發生，CUEDC2在其中的作用還有待研究。Gao等[4]發現：CUEDC2 除了在細胞周期、NF-κB信號通路調節發揮重要作用，而且在多種腫瘤組織中表達上調，參與了腫瘤的發生、發展。

本研究免疫組化染色發現，CUEDC2在多數肝癌組織中均有表達，高表達占47.8% (89/186)。重要的是隨著肝癌細胞分化程度的降低CUEDC2表達呈現升高趨勢，提示CUEDC2參與了肝癌的惡性生物學行為。CUEDC2與肝癌臨床病理因素間的關系發現：CUEDC2表達水平與術前血清AFP水平、腫瘤大小、腫瘤數目、腫瘤分化程度、TNM分期相關，而與其它因素無顯著相關，提示CUEDC2可作為血清AFP的協同預測指標。本組病例中的大腫瘤，多發腫瘤，組織細胞分化差及分期較晚的肝癌CUEDC2呈相對高表達，推測CUEDC2可能參與了肝癌細胞的惡性增殖過程，具有潛在的促癌功能，與以往的研究結果一致[4, 11]。

CUEDC2與多種腫瘤組織耐藥有關。Pan等[12]在449例乳腺癌樣本中CUEDC2的表達顯著增高，而且與 ER水平呈現負相關。機制上證明CUEDC2可使ER泛素化降解，并促進腫瘤細胞增殖，導致內分泌治療耐藥[13]。然而，CUEDC2卻可以使慢性粒細胞白血病細胞對依馬替尼的耐藥性逆轉[14]。說明CUEDC2在不同腫瘤的耐藥中具有不同的作用機制。一直以來，索拉非尼耐藥是制約肝癌分子靶向治療的瓶頸，CUEDC2在索拉非尼耐藥中是否有作用及其作用機制，是我們今后值得探索的問題。

Cox單因素分析發現影響肝癌預后(OS和RFS)的因素包括CUEDC2表達、術前血清AFP水平、腫瘤大小、腫瘤數目、腫瘤分化程度和TNM分期。肝癌血管侵犯是預后不良的標志，本組未得出顯著意義，考慮與本組中血管侵犯病例數較少(n=4)有關。CUEDC2低表達患者的術后總生存率及無復發生存率均較高表達者顯著提升。CUEDC2低表達患者的5年總生存率為54.2%，無復發生存率為39.1%；高表達患者的5年生存率為35.4%，無復發生存率為33.5%。提示CUEDC2參與了肝癌的惡性生物學行為，促進肝癌的病情進展。

表2 影響186例肝癌術后總生存期與無復發生存期的單因素分析

CI: confidence interval; HR: hazard ratio.

表3 影響186例肝癌患者術后總生存期與無復發生存期的Cox模型多因素分析

CI: confidence interval; HR: hazard ratio.

Figure 3.Overall survival (OS) curve (left) and recurrence-free survival (RFS) curve (right) were generated by Kaplan-Meier method. Cumulative survival rates (OS and RFS) in CUEDC2 high expression group were significantly shorter than those in low expression group.

更重要的是Cox多因素回歸分析發現，CUEDC2表達狀態，術前血清AFP水平、腫瘤數目均是肝癌預后的獨立危險因素，提示在Cox多因素回歸模型中CUEDC2表達在影響肝癌預后諸因素中的貢獻較大，對肝癌具有很好的預后預測價值。

綜上所述，CUEDC2在肝癌中存在普遍表達，其表達狀態與血清AFP水平、肝癌的大小、數目、分化程度和TNM分期有關，CUEDC2高表達可以作為肝癌預后不良的預測指標，我們的證據提示CUEDC2在肝癌中可能發揮了促癌作用，但是CUEDC2在肝癌形成、發展中的具體功能及分子機制尚需進一步研究。

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Prognostic significance of CUEDC2 expression in hepatocellular carcinoma

WANG Bo-qing1, XUE Feng1, DING Wei1, TANG Jian-jun2, KANG Tie-bang2, MAIMAITI Maolaaisha1, LI Hai-jun1, TANG Jin-tian1, DONG Xiao-gang1, YIN Ji-wei1, ABULA Yimamumaimaitijiang1, YI Chao1, XU Lin1, TONG Qing1, ZHANG Guo-qing1

(1DepartmentofHepatobiliarypancreaticSurgery,AffiliatedTumorHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;2StateKeyLaboratoryofOncologyinSouthernChina,SunYat-senUniversityCancerCenter,Guangzhou510060,China.E-mail:dingwei2@medmail.com.cn;zgqprofessor@sina.com)

AIM: To investigate the expression of CUE domain-containing 2 (CUEDC2) in hepatocellular carcinoma (HCC) and to analyze its clinical prognostic significance. METHODS: Total 186 formalin-fixed paraffin-embedded tissues obtained from surgical HCC with detailed clinicopathological and follow-up data were used. The expression of CUEDC2 was detected by immunohistochemistry. The relationships between the expression of CUEDC2 and clinicopathological characteristics and prognosis were analyzed. RESULTS: The positive rate of CUEDC2 in HCC was 85.5% (159/186), among which, the low expression was 52.2% (97/186) and the high expression was 47.8% (89/186). CUEDC2 expression was correlated with serum alpha-fetal protein (AFP) level, tumor size, tumor number, tumor differentiation and TNM stage (P<0.05). Kaplan-Meier survival curves showed that the patients with high expression of CUEDC2 were associated with significantly shorter overall survival and recurrence-free survival than those with low CUEDC2 expression (P<0.05). Multivariate Cox regression analysis revealed 3 independent prognostic factors including CUEDC2 expression, serum AFP and tumor number. CONCLUSION: CUEDC2 was expressed in most HCC tissues, which was relevant to tumor growth, tumor differentiation and prognosis. CUEDC2 could be a novel valuable molecular marker to predict the HCC prognosis.

Liver neoplasms; Hepatectomy; CUEDC2 protein; Prognosis

1000- 4718(2015)01- 0124- 06

2014- 07- 23

2014- 09- 25

新疆醫科大學校內重點特色學科項目(No. XYDXK50780306)

△通訊作者 Tel: 0991-7819316； E-mail: dingwei2@medmail.com.cn; zgqprofessor@sina.com

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10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.024