亞硒酸鈉對UVB損傷人角質形成細胞的保護作用

劉賽君， 郭梅艷， 鄧列華， 趙 剛， 胡云峰

(1暨南大學附屬第一醫院皮膚科，廣東 廣州 510630； 2河北工程大學附屬醫院，河北 邯鄲 056002)

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亞硒酸鈉對UVB損傷人角質形成細胞的保護作用

劉賽君1▲， 郭梅艷2▲， 鄧列華1△， 趙 剛1， 胡云峰1

(1暨南大學附屬第一醫院皮膚科，廣東 廣州 510630；2河北工程大學附屬醫院，河北 邯鄲 056002)

目的： 研究亞硒酸鈉(Na2SeO3)對中波紫外線(UVB)損傷人角質形成細胞的保護作用。方法： 培養永生化人角質形成細胞(HaCaT細胞)，實驗分為4組處理：(1)正常對照組；(2)Na2SeO3組：分別加入1 nmol/L、10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L和1 μmol/L 的Na2SeO3預孵育24 h；(3)UVB組：300、600和900 J/m2UVB照射；(4)Na2SeO3+UVB組：Na2SeO3預孵育24 h后進行UVB照射。采用MTT法檢測細胞增殖活性，采用流式細胞儀檢測300 J/m2UVB照射后細胞的凋亡率。結果： (1)UVB組與正常對照組比較，細胞增殖活性顯著降低(P<0.05)，細胞活性與UVB照射劑量呈負相關；(2)Na2SeO3組與正常對照組比較，細胞增殖活性無明顯差異；(3)不同濃度Na2SeO3+UVB組與UVB組比較，細胞增殖活性增加，差異顯著(P<0.05)，其中100 nmol/L組促進細胞增殖作用最強；(4)300 J/m2UVB照射后，不同濃度Na2SeO3+UVB組與UVB組比較，凋亡率下降，差異顯著(P<0.05)，其中100 nmol/L組抑制凋亡作用最強。結論： UVB對角質形成細胞有損傷作用，且與照射劑量呈正相關；Na2SeO3具有光保護性能，可減輕UVB輻射損傷人角質形成細胞。

紫外線； 角質形成細胞； 光保護； 亞硒酸鈉

長期、過量的紫外線輻射可導致皮膚日曬傷、光老化甚至皮膚腫瘤[1-2]。中波紫外線(ultraviolet-B, UVB)是造成皮膚光損傷的主要原因[3]。角質形成細胞位于皮膚表皮層，是UVB作用的靶細胞。UVB引起皮膚光損傷的機制較復雜，最為重要的一點是通過氧化應激產生過多的活性氧簇[4]，破壞細胞膜、線粒體膜及使各種細胞酶類失活，并影響相關細胞信號轉導和基因表達，導致細胞損傷、細胞凋亡或癌變，從而引起皮膚光老化，誘發皮膚癌等。

微量元素硒是機體重要的抗氧化酶——谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的必需組分，具有抗氧化、抗腫瘤[5]、保護心肌和肝細胞[6-7]、提高免疫功能的作用，與人體健康密切相關。研究表明硒與一些皮膚病如銀屑病、白癜風、皮膚腫瘤等的發生發展密切相關[8]，亞硒酸鈉(sodium selenite，Na2SeO3)是一種常用的人體補硒制劑。本論文擬研究不同劑量Na2SeO3處理對UVB照射損傷永生化人角質形成細胞(HaCaT細胞)的保護作用。

材 料 和 方 法

1 細胞、主要試劑和儀器

永生化人角質形成細胞株(HaCaT細胞)購自中國典型培養物武漢大學保藏中心。

胰蛋白酶和四甲基偶氮唑藍(MTT)粉(Sigma)；MEM培養基(Gibco)；胎牛血清(天津市灝洋生物制品公司)；Na2SeO3(廣州化學試劑廠)；UVB燈管(北京電光源研究所)；紫外線輻照計(北京師范大學光電儀器廠)；CO2培養箱(NAPCO)；可見光分光光度計(PERKIN ELMER)；流式細胞儀(Coulter)；倒置相差顯微鏡(Olympus)。

2 方法

2.1 細胞培養 HaCaT細胞在37 ℃、5% CO2條件的細胞培養箱中，用含10%胎牛血清的MEM培養基培養。將處于亞融和狀態的細胞用0.25%胰酶和0.03% EDTA消化傳代，1×108/L細胞密度接種于培養板中。

2.2 分組處理 HaCaT細胞處理分為4組：(1)正常對照組；(2)Na2SeO3組：加入1 nmol/L、10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L和1 μmol/L的Na2SeO3預孵育24 h；(3)UVB組：細胞用300、600和900 J/m2的UVB照射；(4)Na2SeO3+UVB組：Na2SeO3預孵育24 h后行UVB照射；每組設3個復孔，重復實驗3次。

2.3 UVB 照射 2根平行UVB燈管，波長為308 nm，功率為8 W，光源距培養板垂直距離為6 cm，用UVB紫外線輻照計標定輻照強度為2 W/m2。UVB劑量=UVB輻照強度(W/m2)×時間(s)，劑量300、600和900 J/m2。照射前吸去細胞培養液，用PBS沖洗1次，再加入少量PBS覆蓋底面。UVB照射后，棄去覆蓋液PBS，加入培養基繼續培養24 h。

2.4 光損傷的細胞形態學觀察 用倒置相差顯微鏡觀察細胞損傷的形態變化并攝像。

2.5 MTT法檢測細胞增殖活性 向每100 μL培養基中加入20 μL濃度為5 g/L的MTT，37 ℃繼續孵育4 h，棄去上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)溶解，室溫下振蕩15 min，使藍紫色結晶物充分溶解，選擇490 nm波長在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收值(A值)。

2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡率 經300 J/m2UVB照射后，分別檢測正常對照組、UVB組和Na2SeO3+UVB組細胞的凋亡率。將各組細胞用0.25%的胰蛋白酶消化，離心收集細胞，以體積分數80%乙醇固定。PBS清洗細胞3次。取出4 ℃保存的含50 mg/L Triton的碘化丙啶，于各試驗管中分別加入200 μL碘化丙啶，振蕩成單細胞懸液，避光室溫靜置30 min。300目濾網過濾后，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

3 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示。應用SPSS 10.0統計軟件對實驗數據進行t檢驗或單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 UVB照射損傷HaCaT的形態學觀察

正常對照組的HaCaT細胞呈典型上皮樣特征，高核漿比例，細胞排列緊密，輪廓清楚折光好。UVB組細胞受到不同程度損傷，表現為細胞逐漸變圓、皺縮，懸浮細胞增多，細胞腫脹、細胞碎片增多，細胞損傷程度與UVB照射劑量呈正相關，見圖1。

Figure 1.The effect of different doses of UVB irradiation on morphology of HaCaT cells (×100).

2 UVB照射對HaCaT細胞增殖的影響

經MTT檢測發現UVB組A值低于正常對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。說明不同劑量UVB照射后24 h，HaCaT細胞增殖活性下降，細胞活性與UVB照射劑量呈負相關。

Na2SeO3組細胞活性與正常對照組比較無顯著差異(P>0.05)，說明所加藥物在實驗濃度對細胞無毒性作用。

濃度為1 nmol/L的Na2SeO3+UVB組細胞活性與UVB組比較無顯著差異(P>0.05)；其它濃度的Na2SeO3+UVB組的細胞活性與UVB組比較細胞活性顯著升高(P<0.05)，其中100 nmol/L組細胞活性最高,見表1。

表1 UVB照射和Na2SeO3處理后MTT實驗的吸光度值

#P<0.05vsnormal control group (0 J/m2UVB);*P<0.05vsUVB group (0 nmol/L Na2SeO3).

3 Na2SeO3對UVB照射后HaCaT細胞凋亡率的影響

經流式細胞術檢測，在用碘化丙啶熒光染料分析圖上，經300 J/m2UVB照射后，HaCaT細胞中的凋亡細胞在G1/G0期前出現亞二倍體峰，UVB組凋亡率與正常對照組相比較，差異顯著(P<0.05)，表明UVB輻射誘導HaCaT細胞發生凋亡。

經300 J/m2UVB照射后，1 nmol/L Na2SeO3+UVB組的細胞凋亡率與UVB組比較無顯著差異(P>0.05)；其它濃度的Na2SeO3+UVB組細胞凋亡率較UVB組明顯下降(P<0.05)，其中100 nmol/L組凋亡率最低。這說明Na2SeO3對UVB照射致HaCaT細胞損傷具有光保護作用，抑制其凋亡,見圖2。

Figure 2.The effects of Na2SeO3 on the apoptotic rate of HaCaT cells induced by 300 J/m2 UVB. Mean±SD. n=3. #P<0.05 vs control group; *P<0.05 vs UVB group.

討 論

日光中的紫外線對皮膚曬傷、皮膚炎癥、皮膚老化與皮膚癌的發生與發展有重要影響[1-3]。自然界能穿過臭氧層引起人皮膚損傷的紫外線成分是UVB(280～315 nm)和UVA(315～400 nm)，UVB對皮膚的損傷強度比UVA大800～1 000倍，且UVB有更強的誘變性和致癌性，是造成皮膚光損傷的主要原因[2-3]。一般認為，UVB照射損傷皮膚細胞，其具體機制較為復雜。王會營等[9]認為HaCaT細胞經紫外線照射后，線粒體去極化作用增強、質量降低，這些變化與細胞凋亡相關。此外，紫外線能誘導皮膚產生過多的活性氧簇，引起細胞凋亡造成皮膚損傷[4]。我們的研究發現，300、600和900 J/m2UVB照射均導致HaCaT細胞增殖活性下降，且其程度與UVB照射劑量呈正相關。同時，結果也表明300 J/m2UVB輻射即可誘導HaCaT細胞凋亡。一般認為，UVB到達地球表面時輻射強度約為180～300 J/m2[10]，這說明正常日曬條件下的UVB劑量即可損傷皮膚。研究表明，局部外用抗氧化劑如維生素C和E、茶多酚等可以減緩紫外線損傷皮膚[11]。

硒是人體必需的微量元素，適量的硒化合物可保護細胞和細胞膜的結構功能不受氧化作用的損傷。而關于硒緩解紫外線損傷皮膚的研究也有不少報道，如Burke等[12]發現局部外用硒蛋氨酸可以減輕UV輻射引起的炎癥和色素沉著，并可降低UV誘發的皮膚腫瘤的數量。Rafferty等[13]則發現10 nmol/L～1 μmol/L 的Na2SeO3具有光保護作用，能抑制寬譜紫外線(包括UVB、UVA和少量UVC)輻射引起的原代培養人角質形成細胞凋亡。而我們的研究也發現，10 nmol/L～1 μmol/L Na2SeO3能抑制UVB照射引起的HaCaT細胞凋亡，增加細胞增殖活性，說明亞硒酸鈉對HaCaT細胞具有很好的保護作用。從本論文研究結果來看，100 nmol/L為其最佳保護濃度。但硒對UVB輻射的光防護作用機制目前仍未完全清楚，尚待進一步研究闡明。一般認為，硒化合物在體內主要是通過硒蛋白介導其保護作用。人類皮膚細胞表達至少15種硒蛋白，包括谷胱甘肽過氧化物酶和硫氧還蛋白還原酶家族，均有抗氧化活性，能減緩紫外線對皮膚造成的氧化損傷。UVB誘導的細胞凋亡由Fas或P53通路介導，氧化應激參與P53的激活[13]。有研究認為硒化合物具有抗氧化作用，能抑制UVB誘導的皮膚細胞P53激活和蛋白聚集[14]，從而阻止細胞凋亡。此外Na2SeO3能抑制UVB誘導的caspase-3活化，而caspase-3是UV輻射通過能量沉積損傷細胞的關鍵酶[15]。

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Protective effect of sodium selenite on human keratinocytes from ultraviolet-B irradiation

LIU Sai-jun1, GUO Mei-yan2, DENG Lie-hua1, ZHAO Gang1, HU Yun-feng1

(1DepartmentofDermatology,TheFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510630,China;2AffiliatedHospitalofHebeiUniversityofEngineering,Handan056002,China.E-mail:liehuadeng@126.com)

AIM: To investigate the protective effect of sodium selenite (Na2SeO3) on human keratinocytes under ultraviolet-B (UVB) irradiation. METHODS: The cultured HaCaT cells were divided into 4 groups: (1) normal control group; (2) Na2SeO3group: pretreated with Na2SeO3at doses of 10 nmol/L, 50 nmol/L, 100 nmol/L, 200 nmol/L and 1 μmol/L for 24 h; (3) UVB group: irradiated with UVB at doses of 300, 600 and 900 J/m2; (4) Na2SeO3+ UVB group: after pretreated with Na2SeO3for 24 h, irradiated with UVB at doses of 300, 600 and 900 J/m2. The cell proliferation was detected by MTT assay. The apoptotic rates of HaCaT cells treated with UVB at dose of 300 J/m2were assessed by flow cytometry. RESULTS: Compared with normal control group, the cell proliferation activity in UVB group decreased significantly (P<0.05). The cell activity was inversely correlated with the irradiation intensity. No significant difference of the cell activity between Na2SeO3group and normal control group was observed. The cell proliferation in Na2SeO3+UVB group was higher than that in UVB group significantly (P<0.05). Na2SeO3at concentration of 100 nmol/L showed the strongest activity to promote cell proliferation. After 300 J/m2UVB irradiation, the apoptotic rate in Na2SeO3+UVB group decreased significantly (P<0.05) compared with UVB group. The inhibitory effect of Na2SeO3at concentration of 100 nmol/L on apoptosis was the strongest.CONCLUSION: The damage of human keratinocytes by UVB irradiation is in a dose-dependent manner. The photoprotection performance of Na2SeO3reduces the damage of human keratinocytes induced by UVB irradiation.

Ultraviolet rays; Keratinocytes; Photoprotection; Sodium selenite

1000- 4718(2015)01- 0177- 04

2014- 08- 25

2014- 11- 10

△通訊作者 Tel： 020-38688115; E-mail: liehuadeng@126.com

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R758.1

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10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.033