PLCE1通過調控p53抑制肺腺癌A549細胞凋亡*

李 昀， 羅學平， 林繼宗， 黃邵洪， 安 軍， 何錦園， 張軍航△

(1中山大學附屬第三醫院心胸外科，廣東 廣州 510630; 2佛山市南海區人民醫院心胸外科，廣東 佛山 528200； 3中山大學附屬第三醫院肝膽外科，廣東 廣州 510630)

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PLCE1通過調控p53抑制肺腺癌A549細胞凋亡*

李 昀1， 羅學平2， 林繼宗3， 黃邵洪1， 安 軍1， 何錦園1， 張軍航1△

(1中山大學附屬第三醫院心胸外科，廣東 廣州 510630;2佛山市南海區人民醫院心胸外科，廣東 佛山 528200；3中山大學附屬第三醫院肝膽外科，廣東 廣州 510630)

目的： 探討磷脂酶Cε1(PLCE1)抑制肺腺癌A549細胞凋亡的作用機制。方法: 選用人肺腺癌細胞株A549作為研究對象。采用real-time PCR和Western blotting法分別檢測PLCE1抑制劑U-73122處理前、后肺腺癌細胞株A549中PLCE1和p53 mRNA和蛋白水平的表達；流式細胞術檢測細胞凋亡。結果: 肺腺癌細胞株A549高表達PLCE1，低表達p53；抑制PLCE1表達后A549細胞中p53表達上調，細胞凋亡明顯增加。結論: PLCE1通過抑制肺腺癌A549細胞株中p53的表達，從而抑制A549細胞凋亡。

肺腺癌； 磷脂酶Cε1； p53； 細胞凋亡； 甲基化； 表觀遺傳學

肺癌是我國常見的惡性腫瘤之一，近年來呈逐年上升趨勢，據中國國家癌癥中心流行病學調查研究表明，肺癌發病率和死亡率已躍居惡性腫瘤第1位[1]，但具體發病機制尚不明確，治療效果不甚理想，總體生存率偏低。抑癌基因p53表達降低與多種腫瘤發生密切相關，包括肺癌[2]。p53可引起細胞周期阻滯、凋亡及維持基因組穩定性從而抑制腫瘤[3]，但p53在肺癌中失活的機制有待進一步闡明。

PLCE1基因編碼的磷脂酶Cε1(phospholipids C epsilon 1，PLCE1)是磷脂酶C家族的成員。磷脂酶Cε1可催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸水解以產生第二信使肌醇1,4,5-三磷酸(inositol 1，4，5-triphosphate，IP3)和二酰基甘油(diacylglycerol，DAG)，在細胞信號轉導過程中起重要作用，調節細胞生長、增殖、分化，影響細胞骨架改變、細胞運動、細胞凋亡、腫瘤生長及發展等生物學行為。

本研究擬通過檢測PLCE1在肺腺癌細胞株A549中的表達，驗證改變PLCE1表達對肺腺癌細胞p53表達及細胞功能的影響，初步闡明PLCE1通過p53途徑在肺腺癌細胞中作用的機制。

材 料 和 方 法

1 材料

PLCE1抗體、p53抗體、兔抗羊及羊抗兔Ⅱ抗、β-actin抗體和PLCE1抑制劑U-73122均購自Santa Cruz；Annexin V試劑盒購自Sigma；DNA純化盒購自Promega；real-time PCR和Western blotting所用試劑均購自Invitrogen；肺腺癌細胞株A549及對照細胞株HEK293均購于中科院上海細胞庫。

2 方法

2.1 細胞培養 肺腺癌細胞株A549及對照細胞株HEK293用含10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、1×105U/L青霉素和0.1 g/L鏈霉素的DMEM細胞培養液，在CO2培養箱內(37 ℃、5% CO2、飽和濕度)連續培養并傳代。培養液每2～3天換液1次。待克隆細胞生長至80%融合時，分離擴大培養。臺盼藍不相容試驗檢測細胞活性，超過98%活性時方用于下一步實驗。

2.2 實時熒光定量PCR TRIzol法提取細胞總RNA并定量，按試劑盒說明進行逆轉錄合成cDNA。應用實時熒光定量PCR儀(MiniOpticon，Bio-Rad上海分公司)檢測，β-actin作為內參照。PCR引物：p53上游引物5’- GGAAATCTCACCCCATCCCA-3’，下游引物 5’-CAGTAAGCCAAGATCACGCC-3’；PLCE1上游引物5’-GAGCTGCAATCGAAGTCTGG-3’， 下游引物 5’- AAGGCCTTCTGTGAGTCCTC-3’； β-actin上游引物5’-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3’， 下游引物 5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3’。反應體系為20 μL，反應條件為95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，39個循環；并在每個循環延伸末端點收集熒光信號，繪制擴增曲線，基因的表達量用2-ΔΔCt表示。

2.3 Western blotting實驗 預冷PBS洗滌細胞3次，加入全蛋白裂解液后冰上裂解10 min收集蛋白。將抽提蛋白用BCA法定量后，取50 μg于100 V泳道進行SDS-PAGE；電泳結束后，以90 V、90 min將蛋白轉移至PVDF膜； 5% TBS牛奶室溫封閉30 min，孵育I抗羊抗p53(1∶1 000)和兔抗PLCE1 (1∶500)4 ℃過夜，II抗(兔抗羊1∶5 000和羊抗兔1∶2 000)室溫孵育1 h。每次抗體孵育后用Tris緩沖液及聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)洗膜。ECL試劑盒進行發光反應，壓片、顯影、定影，觀察蛋白印跡并進行圖像分析。

2.4 細胞凋亡檢測 根據試劑盒進行操作，收集A549細胞先用Annexin V染色，再用碘化丙啶 (propidium iodide，PI)5 mg/L，染色15 min。流式細胞術檢測細胞凋亡率，PI+細胞首先被檢出，Annexin V+細胞頻數在剩余細胞中確定。

3 統計學處理

計量數據用均數±標準差(mean±SD)表示。應用統計學軟件SPSS 19.0進行處理，兩組間比較用Student’st檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 PLCE1在肺腺癌細胞中高表達

采用real-time PCR與Western blotting檢測肺腺癌細胞株A549中PLCE1的表達，結果發現，A549細胞中PLCE1的mRNA和蛋白表達水平明顯高于正常細胞HEK293，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖 1。

Figure 1.A549 cells expressed high mRNA(A) and protein (B) levels of PLCE1. Mean±SD. n=30. **P<0.01 vs HEK293.

2 肺腺癌細胞中p53表達下調

本研究檢測了肺腺癌細胞株A549細胞中p53的表達，結果發現，A549細胞中p53的mRNA和蛋白表達水平明顯低于正常細胞HEK293，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖 2。

Figure 2.A549 cells expressed low mRNA(A) and protein (B) levels of p53. Mean±SD. n=30. **P<0.01 vs HEK293.

3 抑制肺腺癌細胞中PLCE1表達可促進p53表達

采用PLCE1抑制劑U-73122 (5 mmol/L) 與A549細胞共培養，分別于12 h、24 h及48 h檢測A549細胞中PLCE1和p53的表達。結果發現，抑制A549細胞中PLCE1的表達后，p53表達上調，且p53表達水平呈明顯的時間依賴性(P<0.01)，見圖 3。

4 抑制PLCE1促進肺腺癌細胞凋亡

采用PLCE1抑制劑U-73122 (5 mmol/L) 與A549細胞共培養，分別于12 h、24 h及48 h檢測A549細胞凋亡情況。結果表明，A549細胞凋亡明顯增加，凋亡率呈明顯的時間依賴性(P<0.01)，見到圖 4。

討 論

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤[1]，其中約85%為非小細胞肺癌，15%為小細胞肺癌，非小細胞肺癌中腺癌為最常見的病理類型。肺癌發生發展的分子機制多樣，研究表明，基因突變、microRNA表達異常、等位基因高頻率雜合性缺失(LOH)、抑癌基因失活等均可促進肺癌的發生發展。IPASS研究發現，約有60%的亞裔、女性和非吸煙肺腺癌患者發生表皮生長因子受體基因突變[4]；miRNA-21過表達可導致肺癌發生[5]；等位基因3p、5q、9p、11p 和17p存在LOH，抑癌基因p53表達失活，促進肺癌發生[6]。

Figure 3.PLCE1 inhibitor U-73122 (5 mmol/L) upregulated the expression of p53 in A549 cells. A: the bars indicate the levels of PLCE1 mRNA in A549 cells treated with U-73122; B: the immune blots indicate the contents of PLCE1 protein in A549 cells treated with U-73122; C: the bars indicate the levels of p53 mRNA in A549 cells treated with U-73122; D: the immune blots indicate the contents of p53 protein in A549 cells treated with U-73122. ConIgG: isotype IgG used as a control IgG. Mean±SD. n=30. **P<0.01 vs medium group.

Figure 4.Suppression of PLCE1 induced apoptosis of A549 cells. A: the histograms indicate the proportion of apoptotic cells (Annexin V+) treated with U-73122 (5 mmol/L); B: the bars indicate the summarized data of apoptotic cells. mean±SD. n=30. **P<0.01 vs medium group.

磷脂酶Cε1是磷脂酶C家族的成員，在細胞信號轉導過程中起重要作用。PLCE1可催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸水解產生第二信使IP3和DAG。IP3和DAG調節細胞生長、增殖、分化，影響細胞骨架改變、細胞運動、細胞凋亡、腫瘤生長及發展等生物學行為[7]。PLCE1由RAS和Rho家族的小GTP酶和由異源三聚體G蛋白調節，除催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸水解活性外，還具有1個鳥嘌呤核苷酸交換活性的N末端結構域。目前已證實PLCE1與結直腸癌[8]、膀胱癌[9]及食管癌[10]等多種惡性腫瘤相關，但其在不同類型腫瘤中的表達情況不盡一致。研究發現，PLCE1在結直腸癌中表達下調，被認為是結直腸癌的抑癌基因[8]；而膀胱癌及食管癌中PLCE1表達升高，siRNA抑制PLCE1后，可促進p53的表達，同時促進細胞凋亡[10]。本研究發現肺腺癌細胞株A549中PLCE1表達升高，p53表達下降，與我們前期研究[11]肺癌患者腫瘤組織中PLCE1和p53的表達結果一致。

細胞凋亡下調是腫瘤發生發展的重要原因，眾多因子參與細胞凋亡的調控，如MIF通過激活IL-8，繼而Bcl-2表達增加從而抑制凋亡[12]，TNF-α結合死亡受體后激活caspase級聯反應促進細胞凋亡[13]，細胞色素C氧化酶2合成物可誘導p53表達從而促進細胞凋亡[14]。研究證實，p53與細胞凋亡密切相關，p53可轉錄調控靶基因，如bax、puma，特異性活化caspase-9和caspase-3/7后上調Bax/Bcl-2比率，促進p53依賴的細胞凋亡[15]。p53能通過高爾基復合體轉運Fas短暫促進血管平滑肌細胞表面Fas表達并促進Fas-FADD的結合誘導凋亡[16]，表明p53對死亡受體通路和線粒體通路均有影響。通過本研究發現，抑制肺腺癌細胞中PLCE1的表達可促進p53的表達，進而促進肺腺癌A549細胞凋亡。

由此我們推測，PLCE1通過抑制肺腺癌A549細胞株中p53 的表達，從而抑制細胞凋亡，PLCE1可能成為肺腺癌治療的新靶點。PLCE1在其它病理類型肺癌中的表達以及具體作用機制，有待進一步研究證實。

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PLCE1 suppresses apoptosis of lung adenocarcinoma cells via modulating p53 expression

LI Yun1, LUO Xue-ping2, LIN Ji-zong3, HUANG Shao-hong1, AN Jun1, HE Jin-yuan1, ZHANG Jun-hang1

(1DepartmentofCardiothoracicSurgery,TheThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China;2DepartmentofCardiothoracicSurgery,NanhaiPeople’sHospital,Foshan528200,China;3DepartmentofHepatobi-liarySurgery,TheThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:yunmao@163.com)

AIM: To investigate the role of phospholipase C epsilon 1 (PLCE1) in modulating the apoptotic mechanism in lung adenocarcinoma A549 cells. METHODS: PLCE1 inhibitor U-73122 was used to suppress the expression of PLCE1. The expression of PLCE1 and p53 in A549 cells was evaluated by quantitative real-time PCR and Western blotting. Apoptosis was assessed by flow cytometry. RESULTS: A549 cells expressed high level of PLCE1 and low level of p53. Inhibition of PLCE1 markedly increased the expression of p53, and increased the apoptosis of A549 cells. CONCLUSION: PLCE1 suppresses apoptosis of A549 cells via inhibiting the expression of p53.

Lung adenocarcinoma; Phospholipase C epsilon 1; p53; Apoptosis; Methylation; Epigenomics

1000- 4718(2015)01- 0119- 05

2014- 08- 22

2014- 11- 12

中山大學“985”工程項目(No. 82000-31101301)

△通訊作者 Tel: 020-85252230; E-mail: yunmao@163.com

R734.2； R392.11

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.023