亞溶量C5b-9可誘導足細胞的保護性自噬應答*

呂倩影， 周建華， 楊鳳杰， 蒲金赟， 張 瑜

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院兒科，湖北 武漢 430030)

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亞溶量C5b-9可誘導足細胞的保護性自噬應答*

呂倩影， 周建華， 楊鳳杰， 蒲金赟， 張 瑜△

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院兒科，湖北 武漢 430030)

目的： 通過亞溶量補體C5b-9(sC5b-9)攻擊足細胞的離體模型，探討自噬在免疫介導足細胞損傷過程中的作用。方法: 建立sC5b-9攻擊足細胞體外模型，采用單丹磺酰尸胺(MDC)染色標記自噬泡，瑞氏-吉姆薩染色光鏡下觀察細胞形態，免疫熒光檢測nephrin的表達及分布，Western blotting檢測LC3-II和LC3-I的表達，MTT法檢測細胞存活率，Annexin V/PI雙染法流式細胞術檢測細胞凋亡。結果: 成功建立sC5b-9攻擊足細胞體外模型，將細胞溶破率≤5%定義為亞溶量攻擊。MDC染色和自噬標志LC3-II的檢測均顯示造模后48 h足細胞的自噬活動明顯活躍。抑制自噬可明顯加重sC5b-9所致的足細胞形態異常。sC5b-9攻擊可使足細胞nephrin的表達量明顯減少，并且異常分布，而抑制自噬可進一步下調nephrin的表達。抑制自噬可促進sC5b-9所誘導的足細胞凋亡。結論: sC5b-9可直接誘導足細胞自噬活動增強，而自噬則在sC5b-9介導的足細胞損傷過程中發揮著保護作用。

自噬； 足細胞； 亞溶量C5b-9

足細胞是腎小球濾過膜的重要屏障，常常遭受細菌毒素、炎癥因子、免疫復合物、病理代謝產物等多種損傷性打擊，其作為一種高度分化細胞，在體內分裂增殖能力有限，一旦受損很難通過再生修復。近年研究表明，足細胞損傷和缺失是慢性腎臟病進展的主要決定因素之一[1-2]。因此，對足細胞修復機制的探討可能為延緩腎小球疾病的進展提供新的突破口。以往，我們對大鼠被動Heymann腎炎(passive Heymann nephritis, PHN)模型的研究發現，適當增強自噬可減少PHN大鼠的足細胞凋亡，減輕腎臟病變和蛋白尿程度，提示在此病變過程中自噬可能發揮保護性作用[3]。本研究通過建立亞溶量補體C5b-9(sublytic C5b-9, sC5b-9)攻擊足細胞的離體模型，從細胞水平觀察自噬在sC5b-9介導的足細胞損傷過程中的作用。

材 料 和 方 法

1 細胞培養、sC5b-9攻擊足細胞模型的建立及實驗分組

培養小鼠足細胞系MPC5(Peter Mundel 教授惠贈，北京大學第一醫院丁潔教授轉贈)。以含有10% FBS、1×105U/L 青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養基，在5% CO2培養箱內培養。33 ℃下，加入小鼠重組IFN-γ(PeproTech)維持細胞增殖傳代，37 ℃下，去IFN-γ培養14 d誘導其分化。后續實驗均采用分化態足細胞。

sC5b-9攻擊模型的建立：參照文獻[4]的方法制備兔抗MPC5細胞多克隆抗體。以正常人血清作為補體源，建立sC5b-9攻擊足細胞體外模型，取分化態MPC5細胞，無血清RPMI-1640培養基潤洗2次，以兔抗MPC5細胞多克隆抗體(1∶50)致敏足細胞，37 ℃孵育1 h，用無血清RPMI-1640培養基洗滌2次，加入不同稀釋比例的正常人血清(normal human serum，NHS)，37 ℃孵育1 h，收集培養上清，測定其中LDH含量以確定細胞溶破率，將溶破率≤5%定義為亞溶量攻擊。以滅活補體的NHS作對照。

實驗分空白對照(control)組、補體滅活(complement inactivation，complement-I)組、sC5b-9組和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenosine,3-MA)組。其中，補體滅活組和sC5b-9組，是指在兔抗MPC5細胞多克隆抗體致敏足細胞后分別予滅活補體的NHS和亞溶量的NHS干預；而3-MA組，則指在制備sC5b-9攻擊模型前以自噬抑制劑3-MA 5 mmol/L(Sigma)預處理1 h。

2 主要實驗方法

2.1 單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine，MDC)染色標記自噬泡 各組足細胞棄培養液后，以無血清RPMI-1640稀釋的MDC(0.05 mmol/L，Sigma)37 ℃孵育10 min，PBS洗滌3次，立即于激光共聚焦顯微鏡下觀察、攝像。

2.2 Western blotting檢測 各組足細胞經PBS洗滌，裂解液裂解，離心取上清，熱變性處理，以考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。等量蛋白樣品(30 μg)以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后轉移至PVDF膜上，室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h，加Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，PBST洗滌后，加HRP標記Ⅱ抗室溫孵育1 h，PBST洗膜，電化學發光(ECL)顯影，用UVP-2000凝膠圖像分析系統進行定量分析。以GAPDH為內參照。Ⅰ抗包括兔抗鼠LC3(Cell Signaling)和兔抗鼠GAPDH(武漢谷歌公司)。

2.3 瑞氏-吉姆薩染色 取出各組足細胞爬片，PBS洗滌2次，95%乙醇室溫固定30 min，0.05%瑞氏-吉姆薩復合染液孵育10 min，沖洗晾干，置于清潔載玻片上，光學顯微鏡下觀察、攝像。

2.4 細胞免疫熒光染色 取各組足細胞爬片，4%多聚甲醛固定15 min，0.25% Triton X-100 PBS冰上破膜5 min，PBS洗滌，5% BSA封閉30 min，滴加Ⅰ抗：兔抗小鼠nephrin抗體，4 ℃濕盒內孵育過夜，PBS洗滌，滴加FITC標記的Ⅱ抗，于濕盒內37 ℃避光孵育60 min，PBS洗滌，50%緩沖甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察、攝像。

2.5 MTT實驗 向96孔板中的各組足細胞，每孔滴加MTT溶液(5 g/L，Sigma)20 μL，繼續培養4 h，棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，用酶標儀測定吸光度(A490)值，每組設3個復孔計取平均值。重復實驗3次。

2.6 細胞凋亡檢測 胰酶消化收集各組足細胞，PBS重懸制備單細胞懸液，PBS洗滌2次，加500 μL binding buffer重懸細胞，加5 μL Annexin V-FITC混勻，加5 μL PI混勻，室溫下避光孵育10 min，立即上流式細胞儀檢測。

3 統計學處理

采用SPSS 13.0軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 成功建立sC5b-9攻擊足細胞的體外模型

如圖1所示，在足量兔抗小鼠足細胞抗血清致敏的基礎上，以不同稀釋倍數的NHS孵育足細胞，當1∶160稀釋時測得足細胞溶破率為7.2%，減去靜息溶破率2.5%，得到矯正的足細胞溶破率4.7%。因此，本研究中以1∶160稀釋的NHS構建sCb-9攻擊足細胞的體外模型。

Figure 1.The lysis rate of antibody-sensitized podocytes incubated with different dilution of NHS. Mean±SD. n=3.

2 sC5b-9可誘導足細胞自噬

MDC染色顯示，sC5b-9干預后48 h足細胞內的嗜酸性囊泡數量明顯增多(圖2A)；同時，足細胞LC3-Ⅱ的表達明顯增高，而補體滅活組和空白對照組之間無顯著差異(圖2B)。

Figure 2.Evaluation of autophagy in differentiated conditionally immortalized murine podocytes. A: autophagic vacuoles detected by MDC staining (×1 000)； B: examination of LC3 protein level by Western blotting. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs complement -I group.

3 抑制自噬明顯加重sC5b-9所致的足細胞形態異常

sC5b-9干預后48 h足細胞呈現異常形態，表現為胞體回縮，細胞呈細長形，胞漿面積減少，胞膜皺褶增多，足突形成減少，失去典型的“樹枝狀”表型，出現板狀偽足，細胞間連接減少。以3-MA預處理抑制自噬，可使上述病變顯著加重，見圖3。

Figure 3.Cell morphology of differentiated conditionally immortalized murine podocytes (Wright-Giemsa staining, ×400).

4 抑制自噬進一步加重足細胞裂孔膜病變

造模后48 h，與補體滅活組相比，sC5b-9組足細胞裂孔膜蛋白nephrin表達明顯下調，并呈現沿核周聚集的異常分布；與sC5b-9組相比，給予3-MA預處理抑制自噬，可使足細胞nephrin的表達量進一步減少，見圖4。

Figure 4.Nephrin expression in differentiated conditionally immortalized murine podocytes (immunofluorescence staining, ×400).

5 抑制自噬可促進sC5b-9所誘導的足細胞凋亡

如圖5所示，sC5b-9干預后48h足細胞的生存率明顯下降，同時，AnnexinⅤ/PI染色結果顯示，sC5b-9組足細胞凋亡率較補體滅活組增高；與sC5b-9組相比，給予3-MA預處理抑制自噬，可使足細胞生存率進一步減低，凋亡率顯著增高。

Figure 5.Survival rate and early apoptotic rate of the podoctes. A: podocyte viability was measured by MTT； B: podocyte apoptosis was measured by Annexin V/PI staining. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs complement-I group; △P<0.05 vs sC5b-9 group.

討 論

膜性腎病(membranous nephropathy, MN)是一類非炎癥性、器官特異性的自身免疫病，約30%的患者可出現嚴重的腎功能受損，而現有的免疫抑制治療療效十分有限，因此，需要深入探究其進展和修復機制，以尋找新的治療靶點。雖然，在過去的十年中，隨著一系列抗原成分和易感基因的發現，人們對于MN分子機制的認識有了實質性進展，但迄今為止其復雜的免疫發病機理尚未完全闡明[5]。以往研究已證實sC5b-9攻擊足細胞是導致MN發生的核心環節[6]。sC5b-9攻擊可激活一系列信號轉導通路，如蛋白激酶、磷脂酶、活性氧自由基、轉錄因子、生長因子、蛋白酶、內質網應激通路等等，最終這些信號將影響細胞代謝、脂質和細胞骨架的結構及功能、裂孔膜形成等足細胞生物學行為[7]。正如本研究所示，sC5b-9可直接導致離體培養的足細胞失去典型的“樹枝狀”表型，而呈現胞體細長、胞膜皺縮、板狀偽足等異常形態，同時伴有足突減少以及裂孔膜蛋白nephrin的表達下調和分布異常。

足細胞是一類類似于神經元的高度分化細胞，其外部形態呈多突狀，由胞體、主突起和足突三部分構成：漂浮在腎小球Bowman’s的巨大胞體上，向腎小球毛細血管袢伸出長的主突起，而主突起則通過其分出的足突黏附于腎小球基底膜；相鄰的足突規則有序地相嵌形成指狀交叉，其間由裂孔膜橋接，后者完全覆蓋足突間25～55 nm的濾過間隙，構成腎小球濾過的最后一道屏障。因此，足細胞時常面臨免疫攻擊、血流動力學異常、蛋白尿、藥物、感染等諸多損傷因素的干擾，然而作為一種終末分化細胞，在體內其不能以有絲分裂的方式有效應對損傷，故而當損傷性刺激超過了足細胞自我防御能力時，將出現足細胞丟失，如若細胞數目減少10～20%，將導致基底膜裸露及腎小球硬化[8]。凋亡是腎小球足細胞丟失的主要途徑。與以往研究[9]相符，本研究也觀察到sC5b-9可直接誘導足細胞凋亡，在干預后48 h，離體培養的足細胞生存率明顯下降，凋亡率明顯升高。

sC5b-9在激活多條損傷信號通路導致足細胞病變的同時，往往也激活一系列防御機制以限制損傷、促進修復。作為長壽命細胞，“形成自噬體，清除多余或受損的蛋白質及細胞器”是足細胞賴以生存的至關重要的損傷應答機制[10]。自噬是廣泛存在于真核細胞的一種溶酶體依賴的降解途徑，主要調節細胞內廢棄的長壽命蛋白及細胞器的降解，使降解產物被細胞再利用，因此，其在細胞發育、損傷修復、組織重塑及適應性應答等方面發揮著極為關鍵的作用。哺乳動物細胞的自噬反應可分為巨自噬、微自噬、分子伴侶介導的自噬3種，其中巨自噬即通常所指的自噬，其所介導的批量降解是一個嚴格調控的程序性過程。首先，在胞漿中形成一個來源于粗面內質網或高爾基體的扁平雙層膜結構，而后不斷擴張，稱之為“前自噬泡”；前自噬泡不斷延伸，將胞漿中廢棄組分攬入其中，而后邊緣融合，形成密閉的球形雙層膜結構，稱之為“自噬體”；隨后，在細胞骨架蛋白驅動下自噬體與溶酶體融合，形成“自噬溶酶體”，以降解其內容物及雙層膜結構[11]。多數情況下，自噬作為細胞自我修復和對抗死亡的一種保護性應答反應而存在[12-14]。本研究觀察到，以3-MA抑制自噬不僅可明顯加重sC5b-9所致的足細胞形態異常，使裂孔膜蛋白nephrin的表達進一步下降，而且還可促進sC5b-9所誘導的足細胞凋亡。

綜上所述，我們認為，sC5b-9作為損傷因素在致足細胞病變的過程中，同時也誘導足細胞自噬活性增強，而自噬在此過程中發揮著重要的保護性作用。本研究提示增強自噬有望成為治療免疫介導性足細胞病變的措施之一。

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Sublytic C5b-9 induces protective autophagy in cultured podocytes

Lü Qian-ying, ZHOU Jian-hua, YANG Feng-jie, PU Jin-yun, ZHANG Yu

(DepartmentofPediatrics,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China.E-mail:yuzhang497@163.com)

AIM: In podocytes, autophagy occurs at a high basal level and dysregulated autophagy is associa-ted with a variety of podocytopathies. This paper is to investigate the role of autophagy in sublytic C5b-9-induced podocyte injury. METHODS: Sublytic complement C5b-9 stimulation was used as aninvitromodel. Autophagosomes were confirmed using monodansylcadaverine (MDC) staining. Immunoblotting was used to measure the change of autophagy-related markers. Cellular morphological changes were observed by Wright-Giemsa staining. Immunofluorescence staining and confocal microscopy were used to detect the expression and distribution of nephrin. The cell viability was assessed by methylthiazol tetrazolium (MTT) assay. The cell apoptosis was assessed by Annexin V-fluorescein isothiocyanate/PI staining. RESULTS: For ensuring sublytic complement injury, the maximal amounts of anti-podocyte antiserum and 160×-diluted normal human serum were used without inducing cell lysis (defined as >5% LDH release). Sublytic C5b-9 promoted autophagy of podocytesinvitro. The proautophagic effect of sublytic C5b-9 manifested in the form of accumulated MDC-labeled vesicles and enhanced the expression of LC3-Ⅱ. Autophagy inhibitor 3-methyladenosine (3-MA) promoted sublytic C5b-9-induced podocyte morphological abnormalities. Compared with the sublytic C5b-9-injured podocytes, 3-MA exposure further decreased the expression of nephrin. 3-MA enhanced sublytic C5b-9-induced podocyte apoptosis. CONCLUSION: Sublytic C5b-9 attack induces autophagy, which may play a protective role against complement-mediated podocyte injury.

Autophagy; Podocytes; Sublytic C5b-9

1000- 4718(2015)01- 0059- 05

2014- 06- 17

2014- 11- 05

國家自然科學基金資助項目(No. 81100514)； 教育部博士點基金(新教師類)(No. 20110142120017)； 華中科技大學自主創新研究基金(No. 2013QN192)

△通訊作者 Tel： 027-83663297； E-mail: yuzhang497@163.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.012