PPARγ激動劑通過上調解偶聯蛋白2抑制高糖介導的內皮細胞活性氧生成*

王沛堅， 王秋林， 楊 震， 王 芳， 蒲春華， 李文章， 梁登攀， 周 鵬

(成都醫學院第一附屬醫院心內科,四川 成都 610500)

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PPARγ激動劑通過上調解偶聯蛋白2抑制高糖介導的內皮細胞活性氧生成*

王沛堅， 王秋林， 楊 震， 王 芳， 蒲春華， 李文章， 梁登攀， 周 鵬△

(成都醫學院第一附屬醫院心內科,四川 成都 610500)

目的： 探討過氧化物酶體增殖物受體γ(PPARγ)對高糖介導的血管內皮細胞活性氧(ROS)生成的影響及機制。方法: 人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)以高糖(33 mmol/L D-葡萄糖)培養基培養，并以低糖培養基(5.5 mmol/L D-葡萄糖)作為對照。分別利用超氧陰離子和一氧化氮(NO)的熒光探針觀察PPARγ激動劑比格列酮對高糖環境下內皮細胞超氧陰離子和NO水平的影響，以Western blotting法觀察解偶聯蛋白2(UCP2)的表達。結果: PPARγ激動劑比格列酮可顯著抑制高糖介導的ROS生成，并可防止高糖介導的內皮細胞NO水平的下降，而上述作用可被PPARγ的阻斷劑GW9662所阻斷。PPARγ激動劑可上調內皮細胞UCP2的表達，而通過genipin抑制UCP2可顯著減弱PPARγ激動劑的作用。結論: 激活PPARγ可顯著抑制高糖介導的ROS的生成，而該作用可能與其上調UCP2的表達有關。

過氧化物酶增殖物受體γ； 解偶聯蛋白2； 氧化應激； 內皮細胞

糖尿病是心血管疾病的重要危險因素，相關的心腦血管并發癥如腦卒中、冠心病、慢性心力衰竭等是嚴重危害人類健康的重大疾病[1]。最新的調查研究表明，我國目前已有1.14億的糖尿病患者，而成人中更有50%的糖尿病前期患者[2]。因此，對于糖尿病及其相關心血管并發癥的防治是我國面臨的一個重大公共衛生問題。內皮損傷是眾多心血管疾病的起始環節。高糖環境下通過多種途徑如糖基化終末產物、多元醇代謝途徑、腎素-血管緊張素-醛固酮系統激活、線粒體功能障礙等導致血管內皮細胞的損害[3-4]。目前的共識認為，氧化應激是上述的途徑造成血管內皮損害的共同環節[5-6]。但外源性補充抗氧化劑如維生素C和維生素E等對心血管疾病的遠期療效研究結果仍存在一定的爭議[7-8]。研究表明，過氧化物酶體增殖物受體(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)不但具有顯著的代謝保護作用，還由于其特有的抗氧化應激作用對衰老相關的心腦血管功能障礙具有良好的改善作用[9]。但PPARγ對高糖介導的血管內皮氧化應激的影響及其相關的機制尚無相關的報道。在本研究中，我們擬利用高糖復制內皮細胞損傷模型，觀察PPARγ對高糖介導的內皮細胞ROS產生的影響及對其機制進行初步的探索。

材 料 和 方 法

1 細胞和實驗材料

人臍靜脈內皮細胞 (human umbilical vein endothelial cells， HUVECs) 購于江蘇省齊氏生物科技有限公司。

二氧化碳培養箱(SHELDON)；去離子水過濾器(Millipore)； pH 計和核酸蛋白分析儀(Beckman)；勻漿機(IKA)；電泳儀(Bio-Rad)；凝膠掃描成像系統(Bio-Rad)； TE2000-U倒置熒光顯微鏡(Nikon)。

二氫乙啶(dihydroethidium，DHE)、4,5-二氨基乙酰乙酸熒光素(4,5-diaminofluorescein diacetate，DAF-2DA; Sigma)；抗GAPDH抗體和抗UCP2抗體(Santa Cruz)；胎牛血清(Hyclone)，抗生素和DMEM 培養基(Gibco)。

2 方法

2.1 細胞的分組及培養 HUVECs用低糖DMEM培養基 (含10%胎牛血清和1%抗生素)于37 ℃、5% CO2條件下培養。分組處理如下：(1)對照(control)組 (干預時給予同體積的DMSO)；(2) 高糖(high glucose, HG)組(含33 mmol/L的D-葡萄糖DMEM培養基培養)； (3)HG+比格列酮(pioglitazone, PIO)組(高糖培養基培養的細胞中加入比格列酮，10 μmol/L)；(4)HG+PIO+GW9662組(高糖培養基培養的細胞中加入比格列酮10 μmol/L，GW9662 5 μmol/L)；(5)HG+PIO+京尼平(genipin，10 μmol/L)組干預時間為24 h。細胞種于6孔板中，每組至少重復3次。

2.2 DHE染色[10]取適量DHE染料溶于DMSO中配制成0.01 mol/L的儲備液，4 ℃避光儲存。在干預后的血管內皮細胞中加入終濃度為40 mmol/L的染色液，37 ℃避光孵育30 min。用新鮮Krebs溶液洗滌3次后熒光顯微鏡下進行觀察。Krebs 溶液(mmol/L)：NaCl 119,NaHCO325,glucose 11.1,KCl 4.7,KH2PO41.2,MgSO41.2,CaCl22.5,pH 7.4。

2.3 內皮細胞NO水平的測定[10]在干預后的血管內皮細胞中加入終濃度為5 mmol/L的DAF-2DA，37 ℃避光孵育45 min。用Krebs溶液洗滌3次后置于熒光顯微鏡下，用FITC濾光片進行照相。

2.4 Western blotting[10]取100 mg 細胞加入裂解液裂解細胞，提取總蛋白，測定蛋白濃度。蛋白上樣量50 μg，經SDS-PAGE 轉移至PVDF 膜上，封閉后加入 I抗和Ⅱ 抗，化學發光試劑增強反應，X 線片壓片曝光，凝膠成像系統分析結果。

3 統計學處理

以SPSS 13.0 統計分析軟件進行數據錄入及統計分析，數據以均數±標準差 (mean±SD) 表示，采用非配對t檢驗進行組間比較分析，以P<0.05為差異有統計學意義，Prism 3.0 軟件制圖。

結 果

1 PPARγ激動劑抑制高糖介導的HUVECs活性氧生成

與低糖對照組比較，高糖環境可顯著增加內皮細胞ROS的生成 (P<0.01)；PPARγ激動劑比格列酮(10 μmol/L)可顯著抑制高糖環境下活性氧的生成 (P<0.01)；而該作用可顯著被PPARγ阻斷劑GW9662(5 μmol/L)或genipin(10 μmol/L)所阻斷，(P<0.01)，見圖1。

2 PPARγ激動劑顯著防止高糖環境介導內皮細胞NO水平的下降

與低糖對照組比較，高糖環境下內皮細胞的NO水平顯著下降(P<0.01)；PPARγ激動劑比格列酮可顯著防止高糖環境下NO水平的下降(P<0.01)；但該作用同樣可被PPARγ阻斷劑GW9662(5 μmol/L)或genipin(10 μmol/L)所阻斷，見圖2。

3 PPAR γ激動劑可顯著上調UCP2的表達

近年研究發現，PPARγ可調控線粒體蛋白UCP2，而UCP2是近年被發現與氧化應激密切相關的線粒體膜蛋白[11-12]。因此，我們利用Western blotting法分析了PPARγ的激動劑對UCP2的調控作用。結果發現，PPARγ可顯著上調高糖環境下血管內皮細胞UCP2的蛋白表達 (P<0.01)；而該作用同樣可被PPARγ的阻斷劑所阻斷(P<0.01)，見圖3。

Figure 1.The effect of PPARγ agonist on high glucose-induced ROS level elevation in HUVECs.Mean±SD. n=6. ## P<0.01 vs control group; **P<0.01 vs HG group; △△ P<0.01 vs HG+PIO group.

討 論

高糖環境導致氧化應激水平的升高是糖尿病致血管損害的關鍵環節[5]。內皮作為血管組織的第一屏障最先遭受ROS的攻擊。近年發現，PPARs(包括PPAR、PPARβ/δ和PPARγ)不但具有顯著的代謝改善作用，還具有良好的血管保護作用[13]。已知臨床常用的PPARγ激動劑吡格列酮具有顯著的降糖效應，但其是否有獨立于降糖以外的保護糖尿病狀態下血管內皮的效應，目前并無相關的研究報道。在本研究中我們首先觀察了吡格列酮對高糖介導的血管內皮細胞活性氧產生的影響。結果發現PPARγ激動劑吡格列酮可顯著抑制高糖介導的血管內皮細胞氧化應激水平的升高并可被PPARγ的拮抗劑阻斷。氧化應激水平的升高可導致具有內皮保護作用的NO水平下降，從而進一步導致血管內皮結構和功能的損害[14]。我們利用NO的熒光探針進一步分析了吡格列酮對高糖環境下血管內皮細胞NO水平的影響。與既往的研究一致，高糖環境可顯著減少內皮細胞NO的水平，而吡格列酮可顯著防止高糖介導的NO水平的下降。上述結果提示吡格列酮具有顯著的保護高糖介導的血管內皮損害的作用，而該作用是通過激活PPARγ實現的。

但PPARγ對高糖環境介導的血管內皮損傷的保護作用機制是什么？既往研究證實，PPARγ可顯著上調線粒體蛋白UCP2mRNA轉錄水平，而該作用可能依賴于絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的磷酸化[11, 15]。UCP2作為線粒體內膜上的蛋白，其介導的質子漏可降低線粒體膜電位從而防止線粒體活性氧的生成[16]。近年研究發現，UCP2是機體內源性抗氧化應激的一個重要分子，機體氧化應激水平的升高可致其激活，從而使轉錄水平升高，表達增加，是機體應對氧化應激的一種反饋性調節機制。UCP2不但具有對抗衰老介導的活性氧產生的增加，延長壽命的作用，還具有防止高糖介導的血管內皮功能損害，通過過表達UCP2可顯著防止高糖介導的血管內皮功能障礙[17-18]。為此，我們利用Western blotting的方法觀察了PPARγ對UCP2表達的調節作用。結果發現，PPARγ激動劑可顯著上調高糖環境下UCP2的表達水平。為進一步明確UCP2對PPARγ介導的血管內皮保護作用的影響，我們進一步利用UCP2抑制劑genipin觀察其對PPARγ激動劑吡格列酮效應的影響。結果發現，genipin可顯著抑制吡格列酮的作用，提示PPARγ拮抗高糖介導的血管內皮氧化應激損傷的作用依賴于UCP2。

綜上所述，我們的研究結果證實了PPARγ激動劑吡格列酮可顯著防止高糖介導的血管內皮細胞ROS水平的升高，而該作用可能是通過上調UCP2而實現的。雖然已知氧化應激是高糖介導的血管損害的關鍵機制，但維生素C和維生素E等外源性的抗氧化劑防治心血管疾病仍存在一定的爭議。因此，PPARγ調控的內源性抗氧化應激靶點UCP2可為相關心血管疾病的防治提供新的干預思路。

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PPARγ agonist inhibits high glucose-induced production of reactive oxygen species by UCP2 up-regulation

WANG Pei-jian, WANG Qiu-lin, YANG Zhen, WANG Fang, PU Chun-hua, LI Wen-zhang, LIANG Deng-pan, ZHOU Peng

(DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospital,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China.E-mail:ap216g@163.com)

AIM: To explore the effects of PPARγ on the elevated level of reactive oxygen species (ROS) induced by high glucose and its mechanism. METHODS: Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were cultured with DMEM containing high glucose (33 mmol/L D-glucose), and DMEM containing lower glucose (5.5 mmol/L D-glucose) was used as control. Superoxide anion and nitric oxide fluorescence probes were used to observe the effects of PPARγ agonist on ROS and NO productions in the HUVECs. The uncoupling protein 2 (UCP2) protein level in the HUVECs was detected by Western blotting. RESULTS: PPARγ agonist pioglitazone inhibited the ROS generation and prevented the decrease in NO level under high glucose condition, and these effects were reversed by pretreatment with PPARγ antagonist GW9662. The results of Western blotting indicated that PPARγ agonist pioglitazone up-regulated the UCP2 expression under high glucose condition, and this effect was also blocked by GW9662. Inhibition of UCP2 by genipin attenuated the effect of pioglotazone on the ROS production. CONCLUSION: Activation of PPARγ inhibits ROS generation under high glucose condition, and this effect may mediate by up-regulation of UCP2.

Peroxisome proliferator-activated receptor γ; Uncoupling protein 2; Oxidative stress; Endothelial cells

1000- 4718(2015)01- 0049- 05

2014- 05- 22

2014- 11- 11

四川省教育廳科研項目(No. 14ZB0234)；成都醫學院科研項目(No. CYZ13-001)

△通訊作者 Tel: 028-83016644； E-mail: ap216g@163.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.010