硫酸鎳對鯽魚肝胰臟和腸中酶活性的影響

孫建梅　鄭桂紅　劉纏民　等

摘要：為了評價水環(huán)境中Ni2+對魚類的影響，并為預(yù)防和治理淡水漁業(yè)水質(zhì)資源的鎳污染提供一定的理論依據(jù)，采用靜水生物測試法，研究0、10、25、50、100 mg/L NiSO4·6H2O對鯽魚肝胰臟和腸中酶活性的影響。結(jié)果表明：低濃度的NiSO4·6H2O對肝胰臟中脂肪酶、胰蛋白酶、酸性磷酸酶有激活作用，在高濃度時呈抑制作用；而對堿性磷酸酶一直表現(xiàn)為抑制作用。低濃度的NiSO4·6H2O對腸中胰蛋白酶、脂肪酶、ACP和AKP有激活作用，高濃度時呈現(xiàn)出抑制作用。

關(guān)鍵詞：硫酸鎳；鯽魚；肝胰臟；腸；酶活性

中圖分類號： S965.117；S917.4文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0239-03

收稿日期：2014-03-07

基金項目：江蘇省徐州市科技計劃（編號：XF11C051）；江蘇省化學(xué)生物學(xué)優(yōu)勢學(xué)科基金（編號：PAPD）。

作者簡介：孫建梅（1962—），女，江蘇徐州人，副教授，從事動物學(xué)的教學(xué)和科研工作。

通信作者：鄭桂紅，女，山東鄆城人，博士研究生，講師，從事動物生理學(xué)的教學(xué)和科研工作。E-mail： ghzhenghf@163.com。隨著工業(yè)的迅速發(fā)展，大量的鉛、鎘、鎳、汞等重金屬隨污水流入江海湖泊，嚴重破壞了水域生態(tài)環(huán)境，影響魚類的正常生長繁殖[1]。目前，關(guān)于鎳和其他重金屬毒理學(xué)的研究多集中在致死濃度與水生動物體內(nèi)鎳的積累量等方面，而重金屬離子對魚類消化酶活性影響的研究較少[2]。因此，本研究以野生鯽魚肝胰臟和腸中脂肪酶、胰蛋白酶、AKP和ACP為指標(biāo)，研究不同濃度的NiSO4對鯽魚肝胰臟和腸中酶活性的影響，旨在研究Ni2+對魚類消化酶的影響機制，為保證魚類的健康和防治環(huán)境污染提供一定的理論參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗動物野生鯽魚，購自江蘇徐州文沃市場，選擇健康活潑、體表完好的鯽魚100尾，體長（9±2） cm、體質(zhì)量（20±2） g/尾，隨機分為5組，分別為0、10、25、50、100 mg/L NiSO4[3]。放養(yǎng)于室內(nèi)水族箱中，每箱88 L水，以充分曝氣 3 d 的自來水作為靜水水源，24 h持續(xù)充氧，溶氧量為6 mg/L，保持水溫（23±1） ℃、pH值 68。采用靜水法將鯽魚預(yù)飼養(yǎng)1周，預(yù)試驗期間死亡率低于5%，試驗前24 h停止飼喂，試驗期間不換水。

1.1.2藥品和試劑蛋白定量測試盒（100T/96樣）、脂肪酶測試盒（50T/48樣）、胰蛋白酶測試盒（50T/48樣）、酸性磷酸酶（ACP）測試盒（50T/48樣），以上均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；堿性磷酸酶（AKP）測試盒（50T/48樣），0.9%生理鹽水，NiSO4·6H2O。

1.1.3試驗儀器YV-7504單光束紫外-可見分光光度計（上海欣茂儀器有限公司）、電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、BS 124S型電子天平[0.1 mg～120 g，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]、玻璃勻漿器、微量移液槍（1、0.1 mL）等。

1.2試驗方法

隨機抽取毒性試驗96 h之后的鯽魚（至少3尾），解剖取樣，對肝胰臟中各指標(biāo)進行測定，評價NiSO4對鯽魚的影響。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用IBM SPSS Statistics 19.0軟件進行處理。組間數(shù)據(jù)的兩兩比較采用配對樣本進行t檢驗，P<0.05、P<001表示差異顯著、極顯著。

2結(jié)果與分析

2.1NiSO4對鯽魚肝胰臟中胰蛋白酶活性的影響

由表1可知，隨著NiSO4濃度的升高，蛋白濃度呈上升趨勢，且NiSO4濃度越高，蛋白濃度上升越明顯。在NiSO4濃度為50 mg/L時，蛋白濃度顯著上升；在NiSO4濃度為100 mg/L時，蛋白濃度極顯著上升（P<0.01）。當(dāng)NiSO4濃度≤25 mg/L 時，胰蛋白酶活性增強；但當(dāng)NiSO4濃度≥50 mg/L 時，胰蛋白酶活性減弱。可見，低濃度NiSO4對胰蛋白酶活性有促進作用，高濃度NiSO4對其有抑制作用，其中10、100 mg/L NiSO4處理的胰蛋白酶活性與對照差異顯著（P<0.05），25 mg/L NiSO4處理的胰蛋白酶活性與對照差異極顯著（P<0.01）。當(dāng)NiSO4濃度≤25 mg/L時，脂肪酶活性緩慢增強；但當(dāng)NiSO4濃度≥50 mg/L時，脂肪酶活性急劇減弱。可見，低濃度NiSO4對脂肪酶活性有細微的促進作用，高濃度NiSO4對其具有明顯的抑制作用，其中25 mg/L NiSO4處理的脂肪酶活性與對照差異顯著（P<0.05），100 mg/L NiSO4處理的脂肪酶活性與對照差異極顯著（P<0.01）。當(dāng)NiSO4濃度≤25 mg/L時，酸性磷酸酶活性呈增強趨勢，但在50 mg/L之后，酶活性減弱。可見，低濃度NiSO4對酸性磷酸酶活性有促進作用，高濃度NiSO4對其有抑制作用，其中25、100 mg/L NiSO4與對照差異顯著（P<0.05）。堿性磷酸酶活性在NiSO4濃度為10 mg/L時就表現(xiàn)出減弱的趨勢，且隨著NiSO4濃度的升高而減弱得更明顯，在NiSO4濃度為10～50 mg/L 之間時，堿性磷酸酶活性減弱最明顯，其中25、50、100 mg/L NiSO4與對照差異顯著（P<0.05）。表1鎳對鯽魚肝胰臟中胰蛋

由表2可知，隨著NiSO4濃度的升高，蛋白濃度呈上升趨勢，而且濃度越高，蛋白濃度上升越明顯，其中25、50、100 mg/L NiSO4 處理的蛋白濃度與對照差異顯著（P<005）。當(dāng) NiSO4 濃度≤50 mg/L時，胰蛋白酶活性增強；但當(dāng)NiSO4 濃度>50 mg/L 時，胰蛋白酶活性反而會減弱，可見低濃度NiSO4 對胰蛋白酶活性有促進作用，高濃度NiSO4 對其有抑制作用，其中25、100 mg/L NiSO4 處理與對照差異顯著（P<0.05），50 mg/L NiSO4 處理與對照差異極顯著（P<001）。當(dāng)NiSO4 濃度>50 mg/L 時，脂肪酶活性呈緩慢增強的趨勢，但當(dāng)NiSO4 濃度達到100 mg/L時，脂肪酶活性急劇減弱，可見低濃度 NiSO4 對脂肪酶活性具有細微的促進作用，高濃度 NiSO4 對其具有明顯的抑制作用，其中10、25 mg/L NiSO4 處理與對照差異極顯著（P<0.01），50、100 mg/L NiSO4 處理與對照差異顯著（P<0.05）。當(dāng) NiSO4濃度 ≤50 mg/L 時，酸性磷酸酶活性呈增強的趨勢，但當(dāng)其濃度達到 100 mg/L 時，酸性磷酸酶活性減弱，可見低濃度 NiSO4 對酸性磷酸酶活性有促進作用，高濃度 NiSO4 對其具有抑制作用，其中50 mg/L NiSO4 處理與對照差異顯著（P<0.05）。當(dāng)NiSO4 濃度在10～50 mg/L之間時，堿性磷酸酶活性逐漸增強，但當(dāng)其濃度達到100 mg/L時，其活性反而減弱了。酶活性的增強，說明前期對酶有促進作用；后期酶活性開始減弱，表示其對酶出現(xiàn)了抑制作用（P<0.01）。表2鎳對鯽魚腸中酶活性的影響

3結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，鯽魚肝胰臟中脂肪酶、胰蛋白酶、酸性磷酸酶活性在低濃度NiSO4中有所增強，但隨著NiSO4濃度的增加，幾種酶的活性明顯減弱；堿性磷酸酶則一直呈減弱趨勢。可見，在長時間的高濃度NiSO4 脅迫下，鯽魚與植物、哺乳動物[4]類似，其脂肪酶、胰蛋白酶、酸性磷酸酶活性受到了抑制，而堿性磷酸酶活性對NiSO4的影響具有不同的反應(yīng)，其生理機制還有待于從酶活性調(diào)控的分子水平上進行更深入的研究。本研究中的各種酶活性與NiSO4濃度升高的關(guān)系同賈秀英進行的鉛對鯉魚的研究結(jié)果[5]一致，脂肪酶、胰蛋白酶、酸性磷酸酶活性隨時間變化規(guī)律與黃雪琴等的結(jié)果[6]一致，隨著中毒時間的延長，酶活性有所減弱。

魚類肝胰臟是重要的解毒器官，也是主要蓄積重金屬的部位，重金屬離子可以誘導(dǎo)肝胰臟產(chǎn)生金屬硫蛋白[7]，從而降低重金屬的毒性，減少對肝胰臟的損害，但是隨重金屬離子濃度的增加和時間的延長，這種損害會超過金屬硫蛋白解毒的能力，從而抑制肝胰臟的代謝酶活性。本研究結(jié)果表明，肝胰臟中脂肪酶、胰蛋白酶、酸性磷酸酶活性在高濃度NiSO4脅迫下明顯減弱，說明高濃度NiSO4超出了肝胰臟本身的解毒能力，極大地抑制了脂肪酶、胰蛋白酶、酸性磷酸酶的活性。Glzar等研究發(fā)現(xiàn)，高濃度鉛會明顯抑制羅非魚堿性磷酸酶活性[8]，本試驗結(jié)果與其相似；孔祥會等研究發(fā)現(xiàn)，高濃度汞會明顯抑制肝胰臟堿性磷酸酶活性[4]。

腸為魚類重要的消化器官，腸道的健康、酶的工作狀態(tài)都關(guān)系到魚的正常生長和發(fā)育。腸道是魚類疾病傳染的重要途徑之一，腸道功能的下降會導(dǎo)致整個機體的健康水平下降，對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力也會下降，使大量營養(yǎng)物質(zhì)流入水體，造成整個水體的健康水平下降，使魚類的傳染病經(jīng)常發(fā)生，嚴重影響魚類的生存，對整個魚類養(yǎng)殖具有嚴重的破環(huán)作用。

脂肪酶和胰蛋白酶為腸中重要的消化酶，脂肪酶活性的減弱對整個機體的影響是巨大的。脂肪酶是魚腸中重要的消化酶，對魚類營養(yǎng)物質(zhì)的吸收有至關(guān)重要的作用[9-11]。ACP和AKP在蛋白（酶）的去磷化過程中起了很大的作用，在生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收消化和運輸[12]中也起重要作用，此外還是生物體內(nèi)重要的解毒體系[13]。研究Ni2+對脂肪酶、胰蛋白酶、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的影響，有助于了解Ni2+對鯽魚腸中酶以及鯽魚生長發(fā)育的影響，可作為水源鎳污染監(jiān)測的一種生物學(xué)指標(biāo)。

本試驗結(jié)果表明，鯽魚腸中胰蛋白酶、脂肪酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶的活性都隨著NiSO4濃度的增加而呈先增強后減弱的趨勢。當(dāng)NiSO4濃度為0～50 mg/L時，胰蛋白酶、脂肪酶、堿性和酸性磷酸酶均呈增強趨勢，說明該濃度的NiSO4對酶具有激活作用；但當(dāng)NiSO4 濃度為50～100 mg/L時，各酶的活性則呈減弱的趨勢，表明對各酶的活性產(chǎn)生了抑制作用。還有其他類似的試驗均得出了“酶活性隨著濃度的增加呈先增強后減弱”的結(jié)論，例如，NiSO4對大鼠心肝腎 ATPase毒性的試驗研究[14]、鉛對鯽魚酸性磷酸酶、堿性磷酸酶的影響[7]、鎳及其化合物對人和動物的毒性作用[15]、重金屬Cd脅迫對紅樹蜆的抗氧化酶、消化酶活性和MDA含量影響[16]等。由此可見，低濃度 NiSO4 對胰蛋白酶、脂肪酶、ACP和AKP具有不同程度的激活作用，高濃度 NiSO4 對其具有抑制作用。結(jié)合相關(guān)文獻可知，可能是因為低濃度NiSO4 會改變酶的分子結(jié)構(gòu)，使酶活性增強；高濃度NiSO4 會破壞酶的結(jié)構(gòu)，使酶的活性受到抑制。其中，NiSO4 對脂肪酶、胰蛋白酶和AKP的影響極顯著（P<0.01），對其的毒性作用很大；對酸性磷酸酶的影響較小。目前還沒有人研究過鎳對鯽魚腸胰蛋白酶、脂肪酶、ACP和AKP的影響，因此筆者通過研究 NiSO4 對鯽魚腸酶的影響，以期為鯽魚的養(yǎng)殖和保護以及水域的污染狀況提供更多的資料。

參考文獻：

[1]剛葆琪，莊志雄.我國鎳毒理學(xué)研究進展[J].衛(wèi)生毒理學(xué)雜志，2000，14（3）：129-135.

[2]田宏杰，莊平，高露姣. 生態(tài)因子對魚類消化酶活力影響的研究進展[J]. 海洋漁業(yè)，2006，28（2）：158-162.

[3]Zheng G H，Liu C M，Sun J M，et al. Nickel-induced oxidative stress and apoptosis in Carassius auratusliver by JNK pathway[J]. Aquatic Toxicology，2014，147：105-111.

[4]孔祥會，劉占才，郭彥玲，等. 汞暴露對草魚器官組織中堿性磷酸酶活性的影響[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué)，2007，14（2）：270-274.

[5]賈秀英，陳志偉.鎘對鯉魚磷酸酶活性的影響[J]. 上海環(huán)境科學(xué)，1998，17（6）：40-41.

[6]黃雪琴，龍玉博.鎘對江蜆Corbicula fluminalis （Muller） 堿性磷酸酶的影響[J]. 福建師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，1995，11（2）：74-78.

[7]高舉，趙欣平，詹付鳳，等. 鉛對鯽魚堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性的影響[J]. 四川動物，2008，27（2）：201-204.

[8]Glzar A，Mustafa C. Enzymatic responses to metal exposures in a freshwater fish Oreochromis niloticus[J]. Comp Biochem PhysiolC，2007，145（2）：282-287.

[9]高貴，韓四平，王智，等. 脂肪酶活力檢測方法的比較[J]. 藥物生物技術(shù)，2002，9（5）：281-284.

[10]宋波瀾，陳剛，葉富良，等. 軍曹魚幼魚脂肪酶的活力與環(huán)境因子的關(guān)系[J]. 暨南大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版，2007，28（5）：531-536.

[11]洪法水，王玲，吳康，等. Pb2+對胰蛋白酶活性影響的作用機理研究[J]. 無機化學(xué)學(xué)報，2003，19（2）：129-132.

[12]何海琪，孫鳳. 中國對蝦酸性和堿性磷酸酶的特性研究[J]. 海洋與湖沼，1992，23（5）： 555-560.

[13]詹付鳳，趙欣平. 重金屬鎘對鯽魚堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性的影響[J]. 四川動物，2007，26（3）：641-643.

[14]孫應(yīng)彪，朱玉真. 硫酸鎳對大鼠心肝腎ATPase毒性的實驗研究[J]. 中國職業(yè)醫(yī)學(xué)，2001，28（3）：27-28.

[15]蔡躍華. 鎳及其化合物對人和動物的毒性作用[J]. 食品研究與開發(fā)，2005，26（4）：192-193，174.

[16]賴廷和，何斌源，范航清，等. 重金屬Cd脅迫對紅樹蜆的抗氧化酶、消化酶活性和MDA含量的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報，2011，31（11）：3044-3053.